ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE, ОБЛАДАЮЩИЙ КОМПЛЕКСОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 C12N1/20 C12R1/22 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Klebsiella pneumonial при производстве вакцин.

Целью изобретения является штамм Klebsiella pneumonial N 140, обладающий повышенной токсинопродуцирующей способностью.

Штамм Klebsiella pneumonial N 140 выделен от больного ребенка с кишечной инфекцией, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 245.

Штамм Klebsiella pneumonial ГИСК N 245 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки при окраске по Граму грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно.

Культуральные признаки.

При выращивании на 1,5%-ном мясопептонном агаре (pH 7,2) при температуре 35-37^oC штамм растет с образованием мутных слизистых, различных по структуре колоний. При выращивании в бульоне Хоттингера (pH 7,2), температура 35-36^oC в течение 20 ч. дает интенсивное помутнение.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
субпланарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки не менее 90 мг, (Аксенова Е.В. 1980 г.);
интраназальное введение 0,05 мг 20-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 18 мин при явлениях тонических судорог и асфиксии (Войно-Ясенецкая Н.К. 1967 г.);
внутримышечное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,5 см;
в опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн. м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (v/l=1,2);
гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывает некрозы кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая бульонная культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (v/l=0,3).

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3% -ном МПА (pH 7,2-7,4), залитом стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4^oC.

Среды для размножения бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при 35-36^oC в течение 20 ч.

Генетические особенности.

Устойчив к ампициллину, эритромицину, оксациллину, метициллину, карбенициллину, тетрациклину, стрептомицину.

Пример 1. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточный агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 мин. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 ч животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на торзионных весах. При этом центрифугат штамма Klebsiella pneumonial ГИСК N 245 давал разницу между левой и правой лапками не менее 110 мг, а остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин, от 50 до 100 мг. Контроли нативный стерильный бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30 и 35 мг соответственно.

Результаты представлены в таблице.

Пример 2. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч и 500 млн. м.т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 ч животных умерщвляют воздушной эмболией и расчитывают отношение объема эксудата к длине сегмента (v/l). При этом 20-часовая бульонная культура штамма ГИСК N 245 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве и показатель v/l составил 1,2. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель v/l колебался в пределах от 0,6 до 1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема наполненной жидкости к длине сегмента составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, обладающий комплексом факторов патогенности. Использование: биотехнология, термолабильный энтеротоксин, ЛТ-энтеротоксин, анатоксин, Klebsiella pneumaniae, вакцина. Сущность изобретения: новый штамм Klebsiella pneumoniae N 140 обладает повышенной токсикопродуцирующей способностью. Штамм депонирован в коллекции ГИСК и имеет регистрационный номер 245. Штамм может быть использован для получения термолабильного энтеротоксина и анатоксина при производстве вакцин. 1 табл.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК 245, обладающий комплексом факторов патогенности.