ШТАММ БАКТЕРИЙ MORGANELLA MORGANII - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтреотоксина) и анатоксина Morganella morganii, при производстве вакцин.

Целью изобретения является штамм Morganella morganii N 4102, обладающий повышенной токсинопродуктирующей способностью.

Штамм M. morganii, N 4102 выделен от больного ребенка с кишечной инфекцией, допонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 242.

Штамм M. morganii ГИСК 242 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки - при окраске по Граму - грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно.

Культуральные признаки.

При выращивании на 1,5%-ном мясопептонном агаре (pH 7,2-7,4), содержащем 5% эритроцитов кролика, при 35-36^oC штаммы растет с крупных колоний, имеющих ровные края. При выращивании в бульоне Хоттингера (pH 7,2-7,4), температура 35-36^oC, в течение 20 ч, дает диффузное помутнение и нежную пленку на поверхности среды.

Образуют фениланиндезаминозу и индол, не ферментирует лактозу и ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, расщепляет мочевину, продуцирует оритиндекарбоксилазу.

Серологические свойства.

Серотип ОЗ.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина: субплантарное введение мышам массой 15 - 16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки не менее 95 мг (Аксенова Е.В., 1980).

Интраназальное введение 0,05 мг 20-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 20 мин при язвенных тонических судорогах и асфиксии (Войно-Ясенецкая Н.К., 1957).

Внутримышечное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,5 см:
в опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн.м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (V/l = 1,2);
гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает "отек лапки" мышей до 30 мг, не вызывает некроза кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая бульонная культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кроликов (V/l = 0,5).

Условия хранения культуры после леофильной сушки или выращенной в 0,3%-ном МПА (pH 7,2-7,4), залитом стерильным вазелиновым маслом, при 4^oC.

Среды для размножения - бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при 35-36^oC в течение 20 ч.

Генетические особенности: Hly⁺, Ent⁺ : pen^R, Hag(MS⁺/MR⁺) устойчив к пенициллину, ампициллину, эритромицину, метициллину, линкомицину, тетрациклину, гентамицину, стрептомицину.

Пример 1. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 мин. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субиланторно в заднюю левую лапку мышей-самцов массой 15-16 г. Через 24 ч животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на торсионных весах. При этом центрифугат штамм ГИСК 242 давал разницу между левой и правой лапками не менее 95 мг, а остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин, 50-100 мг. Контроль - нативный стерильный бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30 и 35 мг соответственно.

Результаты представлены в таблице.

Пример 2. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч и 500 млн.м.т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 ч животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают отношение объема эксудата к длине сегмента (V/l). При этом 20-часовая бульонная культура штамма M. morganii ГИСК 242 оказалась способной давать накопление жидкости в большом объеме и показатель V/l составил 1,2. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель V/l колеблется в пределах 0,6-1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема наполненной жидкости к длине сегмента составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина и анатоксина Morganella morganii при производстве вакцин. Штамм M.morganii N4102 выделен от больного ребенка с кишечной инфекцией, допонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 242. Условия хранения культуры: после лиофильной сушки или выращенной в 0,3%-ном МПА (PH 7,2 - 7,4), залитом стерильным вазелиновым маслом при 4^oC. Среды для размножения - бульон Хоттингера (PH 7,2 - 7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при 35 - 36^oC в течение 20 ч. Генетические особенности штамма: Hly⁺, Ent⁺ : pen^R, Hag (MS⁺/MR⁺) устойчив к пенициллину, ампициллину, эритромицину, метициллину, ликомицину, тетрациклину, гентамицину, стрептомицину. 1 табл.

Штамм бактерий Morganella morganii ГИСК 242 - продуцент термолабильного энтеротоксина.