СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КРОВЕПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области гуманитарной и ветеринарной медицины и предназначено для лабораторной диагностики кровепаразитарных заболеваний у человека, сельскохозяйственных и мелких домашних животных.

Для диагностики кровепаразитарных заболеваний (гемоспоридиозов) в гуманитарной и ветеринарной медицине используют серологические методы диагностики CFT (complement fixation test), IFAT (indirect fluorescent antibody test), CI-ELISA (competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbemt assay), биопроба на лабораторных животных, например на золотистых хомячках, а также метод PCR (полимеразной цепной реакции) [1-4].

Недостатком вышеперечисленных серологических способов диагностики является трудоемкость и дороговизна, а также отсутствие полной воспроизводимости результатов несколькими методиками. Во многих лабораториях отсутствует оборудование и реактивы, квалифицированный персонал для постановки сложных современных методик, таких как PCR-анализ (метод определения ДНК полимеразной цепной реакцией). Биопроба на лабораторных животных продолжительна по времени - 6 недель, CFT и IFAT - 7-10 дней, CI-ELISA разработан только для крупного рогатого скота.

Ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ морфологической диагностики кровепаразитарных заболеваний по мазку крови [5]. Известный способ заключается в приготовлении мазков из капиллярной крови пальца - в гуманитарной медицине, из яремной вены или капилляров ушной раковины - в ветеринарной медицине. Предметные стекла для мазков моют в порошке, промывают в проточной воде, насухо вытирают и помещают на 30-60 мин в смесь Никифорова (этиловый 96% и диэтиловый эфир в соотношении 1:1), поверхность стекол проверяют на нейтральность, протирают насухо и помещают для хранения в закрытую посуду. Фиксацию мазка на стекле осуществляют либо метанолом 10 мин, либо этанолом 30 мин, с последующим окрашиванием мазков 10-20% раствором водного стандартного красителя азур-эозина (по Романовскому-Гимзе) рН 7,0 в течение 15-30 мин. Краситель с мазков смывают водопроводной водой, промывают дистиллированной водой, доведенной до рН 7,0 раствором двууглекислого натрия. Мазки сушат на воздухе и исследуют с помощью оптической микроскопии с иммерсией. Эритроциты и эндоглобулярные включения приобретают серо-синий цвет.

Способ прост и не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, но у него есть ряд недостатков. Прежде всего это низкая эффективность диагностики кровепаразитарных заболеваний из-за неравномерности распределения пораженных эритроцитов в кровяном русле, и чем больше объем крови в биологическом объекте, тем менее репрезентативной становится капля крови. На мазках, окрашенных красителем, приготовленным на нейтральной воде, эритроциты и внутриэритроцитарные паразиты сливаются в единый серо-зеленовато-синий цвет и без хороших практических навыков врач-лаборант их не диагностирует, что приводит к большому количеству ложноотрицательных результатов.

Технической задачей изобретения является повышение точности диагностики и сокращение времени на анализ.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Производят забор 5 мл венозной крови в шприц или пробирку с антикоагулянтом (можно брать крови больше в зависимости от массы биологического объекта) с последующим центрифугированием 10-15 мин при 1000-3000 об•мин^-1. После центрифугирования в отдельную пробирку отбирают 6-10 мкл плазмы крови и 3-5 мкл концентрированной донной части осадка, тщательно перемешивают. Из полученной взвеси готовят 2-3 мазка (по 5 мкл на стекло); лучше делать на стеклах, предварительно вымытых в растворе серной кислоты с хромовокислым калием, промытых в дистиллированной воде и высушенных в сушильном шкафу или на воздухе. Мазки делают специальным шлифованным стеклом, ширина которого в два раза уже, чем предметного стекла (что позволяет на обычных лабораторных микроскопах смотреть края мазков), и сушат на воздухе. Фиксируют мазки в метаноле 10 мин. Окрашивают мазки 20% раствором стандартного красителя азур-эозина (по Романовскому-Гимзе) рН 5,0 в течение 15-30 мин. Мазки промывают под проточной водопроводной водой и отмывают от избытка красителя метиленового азура в ванночке с дистиллированной водой в сменных водах 15-20 мин. Микроскопию мазков проводят в проходящем свете с иммерсией. Поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляют от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами, и далее по верхнему и нижнему краям мазка. При выявлении эндоглобулярных включений вишнево-сиреневый цвет в эритроцитах оранжевого цвета диагностируют кровепаразитарное заболевание. Затраты времени на постановку окончательного диагноза при микроскопии мазка крови, приготовленного по классической методике, составляет в зависимости от количества паразитов в крови от 15 до 60 и более мин. На исследование мазка, приготовленного заявляемым способом, требуется от 3 до 10 минут.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа является:
- исследуемую кровь предварительно центрифугируют, что позволяет осадить на дно пробирки большинство пораженных бабезиями эритроцитов;
- после центрифугирования отбирают 6-10 мкл плазмы крови и 3-5 мкл концентрированной донной части осадка, что позволяет сохранить вязкость нативной крови (соотношение 2 к 1) и существенно увеличить в мазке количество пораженных бабезиями эритроцитов;
- мазки делают специальным шлифованным стеклом, ширина которого в два раза уже, чем стандартное предметное стекло, что позволяет на обычных лабораторных микроскопах смотреть края мазков.

При этом окрашивание мазка производят красителем, приготовленном на воде рН 5,0 (рН качественной дистиллированной воды), что позволяет лучше окрасить эритроциты в оранжевый цвет, а эндоглобулярные включения контрастно в вишнево-сиреневый цвет.

После окрашивания мазки отмывают от избытка красителя (метиленового азура) в дистиллированной воде 15-20 мин (в сменных водах 3 раза), что позволяет исключить ошибки при диагностике кровепаразитарных заболеваний, так как в мазках четко видны эритроциты оранжевого цвета без посторонних примесей красителя, а эндоглобулярные включения имеют вишнево-сиреневый цвет;
Поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляют от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами, и далее по верхнему и нижнему краям мазка.

Принцип предлагаемой диагностики построен на том факте, что эритроциты, пораженные внутриэритроцитарными паразитами (бабезиями, а также малярийным плазмодием и другими гемоспоридиозами), имеют скорость оседания больше, чем у нормальных непораженных эритроцитов, а в крови образуют конгломераты (агглютинируют между собой), поэтому при центрифугировании их можно легко осадить. Повышается точность прямого определения паразита в крови. Если для качественного мазка необходимо 5 мкл нативной крови, а паразитемия очень низкая (1 пораженныхй эритроцит на 20-100 мкл и более), то можно получить ложноотрицательный результат. Забор крови осуществляют в шприц или пробирку с любым антикоагулянтом (гепарином, трилоном Б, цитратом натрия) в количестве 5 мл что составляет 1000 капель объемом в 5 мкл, можно брать крови больше, чтобы проба крови была максимально репрезентативна. Исследованиями установлено, что пораженные кровепаразитами эритроциты распределяются неравномерно по мазку, большая часть находится (если мазок делается справа налево) по правому, верхнему и нижнему краям мазка, а в центре мазка встречаются пораженные эритроциты в виде отдельных "шлейфов". При диагностике кровепаразитарных заболеваний необходимо осуществлять поиск от начала мазка - места наибольшего скопления эритроцитов с паразитами, и далее по его краям. Заявляемый способ позволяет точно и быстро определить наличие паразитов в крови.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Собака породы немецкая овчарка по кличке Мишель, сука в возрасте 5 лет. Исследование крови из шести точек (из двух ушей и четырех лап) по стандартной методике дало отрицательный результат. Исследование венозной крови заявляемым способом позволило выявить от 5 до 10 пораженных бабезиями эритроцитов в отдельных полях зрения.

Исследования по диагностике бабезиоза у собак (n=114) и кошек (n=23) проведены в лабораторных условиях института. После лечения в городских ветеринарных лечебницах и клиниках, где при исследовании крови получен отрицательный результат на бабезиоз, владельцы животных обращались вновь для постановки диагноза с хроническими дерматитами, локальными и тотальными алопециями, быстрой утомляемостью животных, анорексией, функциональной сердечно-сосудистой недостаточностью, воспалительными явлениями на ушной раковине, в среднем и внутреннем ухе" гематомами ушной раковины, с прогрессирующей кахексией, лимфаденитами, аллергическими реакциями, бронхитами и пневмониями, артритами, нефритами, анемиями, энтеритами и кишечными кровотечениями, иммунодефицитными состояниями, желтушностью и анемичностью кожных покровoв, конъюнктивитами и кератитами, хроническими воспалительными явлениями в репродуктивных органах неясной этиологии.

Исследования мазков крови в клиниках давали отрицательные результаты на бабезиоз. При обработке крови предлагаемым способом в мазке появились эритроциты с крупными трофозоитами внутри и четкими контурированными ядрами в них, что свидетельствовало о наличии в крови либо В. canis - у собак, либо В. felis - у кошек, либо других видов - В. spp. У некоторых животных морфологически можно было выделить несколько видов бабезий. Видовое разнообразие бабезий лучше проводить методом ПЦР. Проведенное этиотропное лечение подтвердило правильность поставленного диагноза и способствовало скорому выздоровлению пациентов.

Пример 2.

Пациент А. , 37 лет является донором со стажем 5 лет. При исследовании мазка, приготовленного из нативной крови по стандартной методике, паразиты в крови не выявлены. Исследование крови заявляемым способом позволило выявить кровепаразитарное заболевание - бабезиоз (от 1 до 3 пораженных бабезиями эритроцитов в поле зрения).

Всего заявляемым способом проведена диагностика кровепаразитарного заболевания у 134 человека с различными хроническими заболеваниями неясной этиологии, с рядом симтомов, идентичных наблюдаемым у животных. У 126 человек в мазках из нативной крови, пораженных бабезиями, эритроцитов было от 1 на весь мазок, до 5 в отдельных полях зрения. При обработке крови заявляемым способом количество бабезий в мазке увеличилось до 5-15 в поле зрения. У 8 человек в 3 мазках из нативной крови не было найдено ни одного пораженного бабезиями эритроцита. После приготовления мазков из центрифугированной крови удалось выявить у них от 1 до 3 пораженных эритроцитов на 2-4 поля зрения (скрытая, слабая паразитемия).

Использование данного способа позволит существенно снизить затраты времени на качественную диагностику при кровепаразитарных заболеваниях, позволит специалистам гуманитарной и ветеринарной медицины эффективно, своевременно и быстро выявлять пациентов с острым и хроническим течением кровепаразитарного заболевания, доноров со скрытым носительством или асимптомным течением заболевания, проводить предварительный контроль донорской крови перед гемотрансфузией.

Способ технически прост, эффективен и доступен в любой лаборатории для качественной диагностики кровепаразитарного заболевания.

Источники информации
1. Krause P.J. et al. Comparison of PCR with Blood Smear and Inoculation of Small Animals for Diagnosis of Babesia microti Parasitemia. - J. Clinical Microbiology - 1996. - Р. 2791-2794.

2. Avarzed A. et al. Monoclonal Antibody against Babesia equi: Characterization and Potential Application of Antigen for Serodiagnosis. - J. Clinical Microbiology. - 1998. - Р. 1835-1839.

3. Boustani M.R., Gelfand J.A. Babesiosis. - Clinical Infectious Diseases - 1996. - Р. 611-614.

4. Lodes M.J., Houghton R.L., Bruinsma E.S. et al. Serological expression cloning of novel immunoreactive antigens of Babesia microti. - Infection of immunity - 2000. - V. 68. - N 5 - Р. 2783-2790.

5. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии: Справочное издание/ И. П. Кондрахин, Н.В. Курилов, А.Г. Малахов и др. - М.: Агропромиздат, 1985. - 287 с.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Способ обеспечивает повышение точности диагностики кровепаразитарных заболеваний и сокращение времени анализа. Проводят забор крови, нанесение последней в форме капли на предметное стекло, формирование мазка, фиксирование мазка на стекле, окрашивание мазка красителем, отмывание мазка от избытка красителя, сушку на воздухе и последующее исследование крови с помощью оптической микроскопии с иммерсией, при этом кровь предварительно центрифугируют, отбирают 6-10 мкл плазмы крови и 3-5 мкл концентрированной донной части осадка, мазок формируют с помощью стекла, ширина которого в 2 раза уже, чем предметное стекло, просматривают мазок в проходящем свете и при выявлении эндоглобулярных включений вишнево-сиреневого цвета в эритроцитах оранжевого цвета диагностируют кровепаразитарное заболевание. Причем окрашивание мазка производят красителем, приготовленным на воде с рН 5,0, а мазок отмывают от избытка красителя дистиллированной водой в течение 15-20 мин и поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляют от начала мазка и далее по верхнему и нижнему краям мазка. 3 з.п.ф-лы.

1. Способ диагностики кровепаразитарных заболеваний, включающий забор крови, нанесение последней в форме капли на предметное стекло, формирование мазка, фиксирование мазка на стекле, окрашивание мазка красителем, отмывание мазка от избытка красителя, сушку на воздухе и последующее исследование крови с помощью оптической микроскопии с иммерсией, отличающийся тем, что кровь предварительно центрифугируют, отбирают 6-10 мкл плазмы крови и 3-5 мкл концентрированной донной части осадка, мазок формируют с помощью стекла, ширина которого в 2 раза уже, чем предметное стекло, просматривают мазок в проходящем свете и, при выявлении эндоглобулярных включений вишнево-сиреневого цвета в эритроцитах оранжевого цвета, диагностируют кровепаразитарное заболевание.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что окрашивание мазка производят красителем, приготовленным на воде с рН 5,0.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что мазок отмывают от избытка красителя дистиллированной водой в течение 15-20 мин.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что поиск эритроцитов, пораженных кровепаразитарными инфекциями, осуществляют от начала мазка и далее по верхнему и нижнему краям мазка.