СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГРУПП РИСКА РАЗВИТИЯ НЕРВНО-ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Область техники: медицина, биохимия, иммунология, психиатрия, неврология.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что нервная и иммунная системы организма являются функционально связанными (Крыжановский Г.Н., Магаева С.В., Макаров С.В. Нейроиммунопатология. - М.: типография при НИИ труда, 1997). Многочисленные данные свидетельствуют о взаимном регулирующем влиянии нейронов и иммунокомпетентных клеток (Абрамов В.В. Взаимодействие нервной и иммунной систем. - Новосибирск: Наука, 1988. Shrikant P., Benveniste E.N. The central nervous system as an immunocompetent organ. Role of glial cells in antigen presentation. - J. Immunol. - 1996. - Vol. 157. - 10. - P. 1819-1822). Создание теории идиотип-антиидиотипической регуляции (теория "иммунной сети") способствовало радикальному переосмыслению биологической роли иммунной системы и ее возможности влиять практически на все процессы, происходящие в организме.

Можно сказать, в настоящее время считается установленным, что иммунная система в норме продуцирует антитела практически ко всем антигенам организма, т.е. регуляторные аутоантитела (Jerne N.K. The generative grammar of the immune system. Nobel Lecture, December 1984. - Bioscience Reports (Printed in Great Britain). - 1985. - Vol. 5. - P. 439-451). Т.о. в крови присутствует определенный уровень данных аутоантител, необходимых для определенных физиологических функций. У этих антител есть свои "функциональные противовесы", или антиидиотипические антитела (АТ2), связывающие их подобно антигену. Есть основания полагать, что их концентрация в кровотоке также поддерживается в определенных физиологических пределах. По нашему мнению, эти открытия имеют огромный в настоящее время практически невостребованный потенциал в плане как создания диагностических систем нового поколения, так и разработки новых методов иммунокоррекции.

Нами была разработана многокомпонентная тест-система, обозначенная нами как ELI-N-1 (от ELISA-detected probability of Neuropathology), которую можно использовать для выявления групп риска развития нервно-психических заболеваний. С помощью данной тест-системы определяют уровень аутоантител к панели белков нервной ткани (или их иммунохимических аналогов) (AT1), уровень соответствующих специфических антиидиотипических антител (АТ2) и коэффициент I, характеризующий отношение АТ2/АТ1.

Аналогом данного изобретения может быть "Способ определения степени риска развития нервно-психических заболеваний", изложенный в патенте на изобретение 2147128 (авторы Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Клюшник Т.П., Будыкина Т.С., Вабищевич Н.К., Гнеденко Б.Б.). Способ, описанный в данном патенте, обладает рядом недостатков.

Так, он не предусматривает динамического наблюдения за уровнями исследуемых аутоантител. Выводы строятся лишь на результатах однократного тестирования. Данный метод не предусматривает определения "функциональных противовесов" исследуемых аутоантител, т.е. соответствующих АТ2, тем более соотношения АТ2/АТ1. Поэтому результаты, получаемые с помощью данного метода, не вполне информативны и не позволяют комплексно оценить изменения в системе гуморального аутоиммунитета к нейроантигенам.

В отличие от метода, рассматриваемого в качестве аналога изобретения, предлагаемый способ позволяет:
- оценивать сывороточный уровень АТ2 к используемым в работе антигенам или их иммунохимическим аналогам;
- определять значения коэффициента I, т.е. АТ2/АТ1;
- проводить динамическое наблюдение за пациентом;
- оценивать не только степень риска развития нервно-психических заболеваний, но и прогнозировать течение имеющихся нервно-психических заболеваний.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа возможно повысить надежность выявления групп риска развития нервно-психических заболеваний. Указанное осуществляется с помощью определения в динамике уровня антител к ряду белков нервной ткани (или их иммунохимическим аналогам), соответствующих АТ2 и коэффициента АТ2/АТ1.

В качестве антигенов целесообразно взять, например, следующие белки: a) S100, б) GFAP (глиофибриллярный кислый белок), в) МР65, г) ФРН (фактор роста нервов); д) ОБМ (основной белок миелина) или их иммунохимические аналоги, например F(аb)₂-фрагменты соответствующих АТ2, специфически связывающие ATI к указанным белкам.

В результате такого обследования выявляются лица с патологически повышенным или патологически пониженным содержанием исследуемых ATI и АТ2, а также со значениями коэффициента I (AT2/AT1), выходящими за границы эмпирически найденного диапазона нормы.

Реализация существенных признаков предлагаемого изобретения осуществляется следующим образом.

I. На планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) сорбируют антигены нервной ткани или их иммунохимические аналоги, например F(аb)₂-фрагменты специфических АТ2 к белкам S100, GFAP, MP65, ФРН и ОБМ. Возможно использование одного, двух, трех, четырех или всех пяти указанных компонентов тест-системы, а также других антигенов нервной ткани или их иммунохимических аналогов.

II. На планшеты для ИФА сорбируют антитела (идиотипические) к антигенам нервной ткани (к тем, которые сорбировали на планшеты - см. п.I) или их вариабельные участки, например F(аb)₂-фрагменты антител к белкам S100, GFAP, MP65, ФРН и ОБМ.

III. На планшеты наносят образцы тестируемых сывороток и эталонной сыворотки.

IV. Выяляют связывающиеся из тестируемых сывороток антитела (идиотипические или антиидиотипические) с помощью конъюгатов антивидовых (вторичных) антител с ферментом, например пероксидазой хрена. Реакцию в лунках планшета проявляют субстратом, например о-фенилендиамином и Н₂O₂.

V. Обрабатывают полученные данные. Определяют интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими эталонную сыворотку. Определяют коэффициент I, который представляет собой отношение AT2/AT1.

Не вытекает из известного уровня техники тот факт, что по комплексной оценке уровеней аутоантител к ряду белков нервной ткани (или их иммунохимическим аналогам), уровней соответствующих АТ2 и коэффициентов АТ2/АТ1 можно судить о течении нервно-психических заболеваний и прогнозе их развития.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ БЕЛКОВ НЕРВНОЙ ТКАНИ
Получение F(аb)₂-фрагментов молекул АТ2 к белкам нервной ткани, т.е. иммунохимических аналогов этих белков, проводили следующим образом. Кроликов породы "шиншилла" иммунизировали F(аb)₂-фрагментами поликлональных антител к белкам нервной ткани, например к S100, GFAP, МР65, ФРН и ОБМ. Из получаемой антисыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к какому-либо из указанных белков выделяли соответствующие АТ2 и в результате протеолитический обработки получали их F(аb)₂-фрагменты, которые использовали для активации планшет.

Для получения поликлональных антител (AT1) к белкам S100, GFAP, ФРН и ОБМ использовали коммерческие препараты данных белков фирмы Sigma (США).

Белок МР65 получали следующим способом. Из свежего мозга крупного рогатого скота любым методом выделяют фракцию клеточных мембран (например, мозг гомогенизируют в 0,15 М NaCl с 0,01 М трис-НСl рН 7,5; центрифугируют 5 мин при 1000 g; полученный осадок отбрасывают. К супертатанту добавляют сахарозу до 0,32 М; повторно центрифугируют 10 мин при 3000 g; осадок отбрасывают; к супернатанту добавляют равный объем 0,32 М сахарозы. Процедуру повторяют 2-3 раза. Затем супернатант разбавляют 2-кратно водой и центрифугируют 60 мин при 20000 g. Собирают осадок клеточных мембран).

Полученные мембраны гомогенизируют в 0,01 М трис-НСl буфера рН 7,0 с 0,2 М NaCl. Центрифугируют, собирают осадок, отмывают его 0,01 М трис-НСl буфера рН 7,5. Гомогенизируют осадок в 0,01 М трис-НСl буфере рН 7,5 с 0,1% тритона Х-100 и 2 М мочевиной. Центрифугируют 60 мин при 20000 g. Супернатант наносят на колонку анионообменника, уравновешенную тем же буфером. Проводят ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl на том же буфере. Отбирают фракцию, элюируемую в диапазоне 0,1-0,3 М NaCl. После диализа против 0,01% тритона Х-100 с 1 М мочевиной на трис-НСl буфере рН 7,5, белки наносят на колонку анионообменника и проводят элюцию в линейном градиенте 0,01-0,6 М KSCN с 0,01% тритона X-100 с УФ-детекцией на 280 нм. Собирают последний пик. Полученный материал используется в работе.

Возможно использование для сорбции на планшеты нативных антигенов нервной ткани, а не F(аb)₂-фрагментов соответствующих АТ2. Однако в этом случае чувствительность детекции определяемых AT1 будет примерно в 1,4 раза ниже, вероятно, за счет различных стерических эффектов.

ПРОВЕДЕНИЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИФА
1. Растворы каждого из компонентов тест-системы ELI-N-1 (например, F(аb)₂-фрагменты ATI и АТ2 к белкам S100, GFAP, MP65, ФРН и ОБМ), диализованные против карбонатного буфера рН 9,2-9,8, вносят в отдельные лунки стандартных 96-луночных плоскодонных планшет для ИФА. Затем планшеты инкубируют 12-18 ч при +2...+4^oС.

2. Удаляют (стряхиванием) из лунок растворы с несвязавшимися компонентами и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфер (например, 0,5% раствор желатина на 0,15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37^oС.

3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (с 0,05% твин-20).

4. Вносят на планшеты образцы тестируемых и эталонной сывороток в разведении 1:200 на отмывочном буфере. Инкубируют 12-18 ч при +4^oС.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции осуществляют следующим образом. Раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антивидовыми антителами к IgG человека вносят во все лунки планшета. Затем планшеты инкубируют 60-90 мин при 37^oС или 12-16 ч при +2...+4^oС, после чего коньюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером. Сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0,01-0,05% о-фенилендиамина с 0,001-0,005% перекиси водовода на 0,01-0,05 М цитратфосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 10-20 мин при комнатной температуре.

7. По достижении оптимального уровня окрашивания реакцию останавливают добавлением 0,2-0,4 М серной кислоты.

8. Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

9. Обрабатывают полученные данные.

а) Из трех дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной и тестируемых образцов сыворотки выбирают среднее.

б) Рассчитывают относительную интенсивность реакции с компонентами тест-системы тестировавшихся сывороток по отношению к реакции эталонной сыворотки (в процентах) по полученным значениям оптической плотности лунок. Рассчитывают коэффициент I, представляющий собою отношение АТ2/АТ1. Коэффициент I рассчитывают для каждой пары АТ1-АТ2.

10. Интерпретируют полученные данные.

В случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов тест-системы не выходит за пределы от 65-135% по сравнению с реакцией эталонной сыворотки, а все определяемые коэффициенты I в пределах 0,7-1,3, данную сыворотку относят к классификационной группе 1 - степень риска развития нервно-психических заболеваний минимальна.

В случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов тест-системы выходит за пределы группы 1, но составляет не менее 40 и не более 180% по отношению к реакции эталонной сыворотки или какой-либо из определяемых коэффициентов I выходит за пределы 0,7-1,3, но составляет не менее 0,5 и не более 1,5, данную сыворотку относят к классификационной группе 2 - слабый риск развития нервно-психического заболевания.

В случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов тест-системы выходит за пределы групп 1 и 2 или коэффициент I выходит за пределы 0,5-1,5, данную сыворотку относят к классификационной группе 3 - высокий риск развития нервно-психического заболевания.

В табл. 1 представлены эмпирические данные, полученные при анализе корреляций между показателями, полученными с помощью тест-системы ELI-N-1, и клиническими наблюдениями.

Как видно из табл.1, вероятность развития нервно-психических заболеваний, так же как и характер их течения, коррелирует со степенью отклонений исследуемых показателей (при условии, если при исследовании в динамике на протяжении нескольких месяцев показатели остаются в пределах одной группы). Чем более выражены эти отклонения, тем больше вероятность развития какого-либо нервно-психического заболевания и тем больше вероятность обострения течения заболевания (если оно уже не наступило). По-видимому, поддержание в крови физиологических концентраций аутоантител к нейроантигенам, соответствующих АТ2, а также определенного баланса между ними, необходимо для нормального функционирования нервной системы.

В качестве эталонной сыворотки брали пулированную сыворотку здоровых лиц определенного возраста: до 3 лет, от 3 до 10 лет, от 10 до 16 лет, от 16 до 50 лет, от 50 до 70 лет, свыше 70 лет, т.е. 5 эталонных сывороток для каждой возрастной группы. При обследовании пациентов и здоровых лиц для постановки использовали ту эталонную сыворотку, которую получали от аналогичной возрастной группы. Это связано с тем, что для каждой из этих возрастных групп характерен свой физиологический уровень исследуемых антител.

Чем больше используется предложенных компонентов тест-системы ELI-N-1, тем более точно можно определить риск развития нервно-психических заболеваний и оценить характер его течения, но увеличивается стоимость анализа. Мы считаем, что предлаженные пять пар АТ1-АТ2 являются одним из наиболее оптимальных вариантов.

Положительный эффект от реализации изобретения сводится к получению тест-системы (диагностикума) ELI-N-1, с помощью которого можно выявить лиц, сыворотки которых содержат аномальные уровни AT1 и АТ2 к нейроантигенам, аномальные соотношения между ними, что является признаком повышенного риска развития нервно-психических заболеваний или риска обострения при его наличии.

При проведении анализа ELI-N-1 следует учитывать, что наличие различных инфекционных, эндокринных и др. заболеваний может влиять на исследуемые параметры, что может привести к неточной интерпретации исследуемых показателей.

Пример 1.

Пациент К., 34 года, страдает с 17 лет вялотекущей шизофренией.

Результаты теста ELI-N-1 приведены в табл.2.

Исследуемые показатели спустя 1,5 мес приведены в табл.3.

В течение последующих 5 мес обострения заболевания не отмечалось.

Пример 2.

Пациент Р. Страдает 5 лет болезнью Паркинсона. Кровь взята во время ремиссии.

Результаты теста ELI-N-1 приведены в табл.4.

Результаты теста ELI-N-1 спустя 2 мес приведены в табл.5.

Результаты теста ELI-N-1 спустя 4 мес после первого анализа приведены в табл.6.

Спустя 1 мес после взятия последнего анализа у пациента наблюдали обострение заболевания.

Пример 3.

Новорожденный Н. Клинически здоров.

Результаты теста ELI-N-1 приведены в табл.7.

Результаты теста ELI-N-1 спустя 3 мес приведены в табл.8.

За ребенком проводилось катамнестическон наблюдение в течение 1,5 лет. Отклонений нервно-психического развития не выявлено.

Пример 4.

Ребенок 2 мес. Клинически здоров.

Результаты теста ELI-N-1 приведены в табл.9.

Результаты теста ELI-N-1 приведены в табл.10.

За ребенком проводилось катамнестическое наблюдение в течение 2 лет. Выявлена задержка нервно-психического развития.

ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ И СОЦИАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Применение диагностической тест-системы ELI-N-1 позволяет проводить мониторинг течения нервно-психических заболеваний, а также выявлять группу риска по их развитию. Это может дать возможность клиницистам своевременно проводить профилактику обострении различной патологии нервной системы, а также ее развития.

Исследование проводится в лаборатории для иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления групп риска развития нервно-психических заболеваний. Проводят иммуноферментный анализ с использованием тест-системы ELI-N-1 - сорбированных на планшеты антигенов нервной ткани (АГНт) или их иммунохимических аналогов, специфически связывающих аутоантитела с направленностью к АГНт, а также идиотипических антител (ATI) или их вариабельных участков, специфически связывающих соответствующие АГНт. При этом в динамике определяют уровень сывороточных ATI, уровень соответствующих антиидиотипических антител (АТ2) и коэффициент (К) 1, представляющий собой отношение АТ2/АТ1. Если интенсивность реакции исследуемой сыворотки (ИРИС) с любым из компонентов тест-системы не выходит за пределы от 65 до 135% по сравнению с реакцией эталонной сыворотки (РЭС), а все определяемые К I находятся в пределах 0,7-1,3, то сыворотку относят к группе 1 - степень риска минимальна; если ИРИС выходит за пределы группы 1, но составляет не менее 40% и не более 180% по отношению к РЭС или какой-либо из определяемых К I выходит за пределы 0,7-1,3, но составляет не менее 0,5 и не более 1,5, то данную сыворотку относят к группе 2 - слабая степень риска; если ИРИС выходит за пределы групп 1 и 2 или К I выходит за пределы 0,5-1,5, то данную сыворотку относят к группе 3 - высокая степень риска развития нервно-психических заболеваний. Способ позволяет повысить эффективность выявления групп риска развития нервно-психических заболеваний. 10 табл.

Способ выявления групп риска развития нервно-психических заболеваний по уровню определяемых в сыворотке аутоантител путем иммуноферментного анализа, с использованием тест-системы ELI-N-1 - сорбированных на планшеты антигенов нервной ткани или их иммунохимических аналогов, специфически связывающих аутоантитела с направленностью к антигенам нервной ткани, отличающийся тем, что компонентами тест-системы также являются идиотипические антитела (AT1) или их вариабельные участки, специфически связывающие соответствующие антигены нервной ткани, при этом в динамике проводят определение уровня сывороточных антител к антигенам нервной ткани (AT1), уровня соответствующих антиидиотипических антител (АТ2), коэффициента 1, представляющего собой отношение АТ2/АТ1, при этом, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов тест-системы не выходит за пределы от 65 до 135% по сравнению с реакцией эталонной сыворотки, а все определяемые коэффициенты I находятся в пределах 0,7-1,3, то сыворотку относят к группе 1 - степень риска минимальна; если интенсивность реакции выходит за пределы группы 1, но составляет не менее 40 и не более 180% по отношению к реакции эталонной сыворотки, или какой-либо из определяемых коэффициентов I выходит за пределы 0,7-1,3, но составляет не менее 0,5 и не более 1,5, то сыворотку относят к группе 2 - слабая степень риска; если интенсивность реакции выходит за пределы групп 1 и 2 или коэффициент I выходит за пределы 0,5-1,5, то сыворотку относят к группе 3 - высокая степень риска развития нервно-психических заболеваний.