СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ РИСКА РАЗВИТИЯ НЕРВНО-ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Область техники: медицина, биотехнология, иммунология, психиатрия, неврология
Уровень техники
В настоящее время множество данных свидетельствуют о том, что иммунная система посредством органоспецифических иммунных реакций (гуморального и клеточного типа) принимает непосредственное участие в регуляции деятельности нервной системы (В. В. Абрамов. Взаимодействие нервной и иммунной систем. Новосибирск, Наука, 1988; А. Б.Полетаев, Регуляторные аутоантитела, в кн: Моноклональные антитела в нейробиологии, Новосибирск, 1995). Можно ожидать, что вызванные разными внешними или внутренними причинами сбои в механизмах иммунорегуляции, в том числе врожденные, могут сопровождаться нарушениями формирования и функционального созревания нервной системы ребенка или развитием нарушений в деятельности нервной системы взрослого человека.

Отличительной особенностью иммунной системы является способность иммунокомпетентных клеток синтезировать и секретировать в общий кровоток антитела к чужеродным антигенам (вирусным, бактериальным). Кроме того, иммунная система каждого организма продуцирует "естественные" регуляторные антитела (аутоантитела) к любым антигенным компонентам собственного организма. Синтез последних в здоровом организме поддерживается в определенных границах, необходимых для выполнения естественными антителами определенных регуляторных функций, а их гиперпродукция (равно как и гипопродукция) могут вести к развитию патологических состояний, в том числе затрагивающих формирование и/или деятельность нервной системы.

Вышесказанное явилось основанием для разработки тест-системы ELI-N (от ELISA-detected probability of Neuropathology), пригодной для прогностической оценки состояния нервной системы с помощью уровней аутоантител, важных как для нормального развития головного и спинного мозга, так и для поддержания полноценной функциональной активности нервной системы взрослого человека.

Аналогом предлагаемого изобретения может служить способ, описанный в патенте РФ N 2045759, зарегистрированный 10.10.1995 ("Способ скрининга нервно-психических заболеваний" авторы: Рубцова М.Ю., Селифанова О.П., Полетаев А.Б.). Способ, приводимый в аналоге данного изобретения, обладает рядом существенных недостатков:
Во-первых, он позволяет регистрировать патологическое увеличение содержания аутоантител лишь к одному белку (S100), что не более чем в 55 случаев является предвестником нервно-психических заболеваний.

Во-вторых, он позволяет регистрировать лишь патологическое увеличение уровня/аффинности антител к белку S100, но не его патологическое снижение.

В-третьих, чувствительность применяемого в аналоге метода детекции аутоантител, основанного на сорбции на планшетах собственно белка-антигена, часто оказывается недостаточной из-за стерических препятствий для связывания нескольких молекул аутоантител, специфичных для разных эпитопов белковой молекулы с одной молекулой белка.

В отличие от рассмотренного выше способа-аналога предлагаемый новый способ позволяет:
- Регистрировать патологические изменения в содержании аутоантител, взаимодействующих с различными белками нервной ткани, что существенно повышает точность прогноза развития нервно-психических заболеваний (до 85%).

- Регистрировать как патологическое увеличение аутоантител к белкам нервной ткани, так и их патологическое снижение, что позволяет получать дополнительную информацию о характере нарушений со стороны нервной системы.

- Повысить (в среднем в 1,5 раза) чувствительность детекции изменений со стороны аутоантител за счет сорбции на планшеты (вместо белков-антигенов) иммунологических аналогов отдельных эпитопов соответствующих белков, а именно F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся "зеркальным отображением" (Coutinho, 1988) антителосвязывающих участков белковых молекул.

Целью заявляемого способа является повышение надежности прогноза нормального или аномального развития центральной и периферической нервной системы у детей и выявление лиц, относящихся к группам риска по возможному развитию нервно-психических заболеваний у подростков и взрослых с помощью оценки уровня/аффинности в сыворотке крови обследуемых аутоантител, взаимодействующих с компонентами тест-системы ELI-N. Эти компоненты представляют собой F(ab)₂-фрагменты антиидиотипических антител, специфически связывающих аутоантитела с направленностью к антигенам нервной ткани (аналоги антигенов) или сами антигены нервной ткани, например: а) белок S100, б) белок GFAP, в) белок MP65, г) белок ФРН. В ходе тестирования выявляются лица, содержащие измененные (патологически сниженные или патологически повышенные) показатели уровня/аффинности аутоантител, участвующих в механизмах развития и деятельности нервной системы.

Поставленная цель достигается путем реализации существенных признаков предлагаемого способа, а именно:
I. В результате сорбции на планшеты для ИФА F(ab)₂-фрагментов антиидиотипических антител, специфически связывающих аутоантитела с направленностью к антигенам нервной ткани (аналоги антигенов), например: а) F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка S100 (F-S100); б) F(ab)₂-фрагментов антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка GFAP (F-GFAP); в) F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка MP65 (F-MP65); г) F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка ФРН (F-ФРН); для сорбции возможно использование и самих антигенов; (возможны варианты: использование для анализа любых одного, двух, трех или всех четырех указанных компонентов тест-системы, а также других антигенов нервной ткани или их иммунохимических аналогов).

II. Нанесения на них тестируемых проб сывороток и эталонной референс-сыворотки, полученной от здоровых лиц аналогичной возрастной группы.

III. Выявлении образующихся антиген-антительных комплексов с помощью конъюгатов вторичных (антивидовых) иммуноглобулинов, меченных ферментом, например пероксидазой хрена.

IV. Проявлении реакции в лунках планшета субстратом, например о-фенилендиамином и H₂O₂.

V. Сравнения интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими референс-сыворотку.

Для проведения анализа ELI-N требуется 0,01-0,02 мл сыворотки крови обследуемого (например, из подушечки пальца).

Не вытекает из известного уровня техники тот факт, что изменения уровня/аффинности аутоантител к нейроантигенам являются предвестниками нервно-психических заболеваний.

Сущность изобретения
Антиидиотипические аналоги белков-антигенов (основные компоненты), используемые в тест-системе ELI-N
1. Получение F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка S100 (F-S100). Для получения данного компонента тест-системы проводили иммунизацию кроликов F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к белку S100; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к белку S100 выделяли соответствующие антиидиотипические антитела и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)₂-фрагменты. Полученный материал использовался в работе.

2. Получение F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка GFAP (F-GFAP). Для получения данного компонента тест-системы проводили иммунизацию кроликов F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к белку GFAP; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к белку GFAP выделяли соответствующие антиидиотипические антитела и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)₂-фрагменты. Полученный материал использовался в работе.

3. Получение F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка MP65 (F-MP65). Для получения данного компонента тест-системы проводили иммунизацию кроликов F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к белку MP65; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к белку MP65 выделяли соответствующие антиидиотипические антитела и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)₂-фрагменты. Полученный материал использовался в работе.

4. Получение F(ab)₂-фрагментов молекул антиидиотипических антител, являющихся аналогами белка ФРН (F-ФРН). Для получения данного компонента тест-системы проводили иммунизацию кроликов F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к белку ФРН; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными поликлональными антителами к белку ФРН выделяли соответствующие антиидиотипические антитела и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)₂-фрагменты. Полученный материал использовался в работе.

Для получения поликлональных антител к белку S-100, глиофибриллярному белку (GFAP) и фактору роста нервов (белку ФРН) использовали коммерческие препараты данных белков фирмы Sigma (США).

Белок MP65 получали следующим способом. Из свежего мозга крупного рогатого скота любым методом выделяли фракцию клеточных мембран (например, мозг гомогенизировали в 0.15 М NaCl с 0.01 М трис-HCl pH 7.5; центрифугировали 5 мин при 1000 g; полученный осадок отбрасывали. К супернатанту добавляли сахарозу до 0.32 М; повторно центрифугировали 10 мин при 3000 g; осадок отбрасывали; к супернатанту добавляли равный объем 0,32 М сахарозы. Процедуру повторяли 2-3 раза. Затем супернатант разбавляли 2-кратно водой и центрифугировали 60 мин при 20000 g. Собирали осадок клеточных мембран). Полученные мембраны гомогенизировали в 0.01 М трис-HCl буфера pH 7 с 0,2 М NaCl. Центрифугировали, собирали осадок, отмывали его 0.01 М трис-HCl буфера pH 7.5. Гомогенизировали осадок в 0.01 М трис-HCl буфере pH 7.5 с 0.1% тритона X-100 и 2 М мочевиной. Центрифугировали 60 мин при 20000 g. Супернатант наносили на колонку анионообменника, уравновешенную тем же буфером. Проводили ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl на том же буфере. Отбирали фракцию, элюируемую в диапазоне 0.15 - 0.3 М NaCl. После диализа против 0.01% тритона X-100 с 1 М мочевиной на трис-HCl буфере pH 7.5 белки наносили на колонку анионообменника и проводили элюцию в линейном градиенте 0.01-0.3 М KSCN с 0.01% тритона X-100 с УФ-детекцией на 280 нм. Собирали последний пик. Полученный материал использовали в работе.

Возможно использование для сорбции на планшеты самих антигенов нервной ткани вместо F(ab)₂-фрагментов соответствующих антиидиотипических антител, однако, в этом случае чувствительность детекции определяемых изменений со стороны аутоантител будет примерно в 1,5 раза ниже за счет стерических препятствий для связывания нескольких молекул аутоантител, специфичных для разных эпитопов белковой молекулы с одной молекулой белка.

Методика проведения непрямого ИФА
1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовят растворы каждого из компонентов тест-системы ELI-N (например, F-S100, F-GFAP, F-MP65 и F-ФРН) на карбонатном буфере pH 9-9,8. Приготовленные растворы вносят в отдельные лунки планшета. Планшеты инкубируют ночь при +2...+4^oC.

2. Удаляют (стряхиванием) из луной растворы компонентов и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0.15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37^oC.

3. отмывают планшеты отмывочным буфером (0.15 М NaCl с 0.05% твин-20).

4. Внесение тестируемых сывороток:
а) в отдельных флаконах или ванночках для иммуноферментного анализа готовят разведения сывороток 1:200 на отмывочном буфере.

б) вносят разведенные сыворотки в лунки.

в) планшеты инкубируют ночь при +4^oC.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции:
а) исходный раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека разводят в необходимое число раз (в зависимости от его активности) отмывочным буфером; б) раствор конъюгата вносят во все лунки планшета; в) планшеты инкубируют 60-90 мин при 37^oC либо 12-16 ч при +2. . .+4^oC. Конъюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером; г) сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (0.01-0.05% о-фенилендиамин с 0.001-0.001% перекиси водовода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 15-20 мин при комнатной температуре.

9. По достижении оптимального уровня окрашивания (через 10-20 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М серной кислоты.

10. Регистрация результатов реакции: Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

11. Обработка полученных данных:
а) Из трех дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной и тестируемых сывороток выбирают среднее (в случае, если из 3 дублей один сильно отличается от двух других, т.е. является заведомо артефактом, его значение не принимают в расчет).

б) По полученным значениям оптической плотности лунок, рассчитывают относительную интенсивность реакции с компонентами тест-системы (например, с F-S100, F-GFAP, F-MP65 и F-ФРН) тестировавшихся сывороток по отношению к эталону (в процентах).

12. Интерпретация полученных данных:
В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов не выходит за пределы от -25% до +45% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе K1 - норма (степень риска развития нервно-психических заболеваний минимальна; малая вероятность наличия нервно-психического заболевания на момент обследования).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы группы K1, но составляет не менее -50% и не более +100% по отношению к реакции сыворотки-этанола, данную сыворотку относят к классификационной группе K2 - умеренные отклонения (слабый риск развития нервно-психических заболеваний; не исключено наличие нервно-психического заболевания на момент обследования).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы групп K1 и K2, данную сыворотку относят к классификационной группе K3 - резкие отклонения (высокий риск развития нервно-психических заболеваний; большая вероятность наличия нервно-психического заболевания на момент обследования).

Эмпирические данные, полученные при анализе клинических наблюдений после проведения анализа по методу ELI-N позволили выявить закономерности, представленные в табл. 1 (см. в конце описания).

Вероятность благоприятного прогноза как в плане развития (нормального формирования) нервной системы у детей, так и в плане нормальной деятельности нервной системы у подростков и взрослых прямо зависит от уровня определяемых аутоантител в сыворотке крови обследуемых, а частота аномалий в формировании и функционировании нервной системы прямо коррелирует со степенью их отклонений. Чем более выражены отклонения, тем выше риск возникновения аномалий функционально-морфологического развития нервной системы и случаев возникновения нервно-психических заболеваний.

В качестве эталона использовали образцы сыворотки здоровых лиц, у которых по результатам исследования нескольких сотен таких образцов уровень/аффинность исследуемых аутоантител имели среднее значение. Использовали эталонные образцы сыворотки для следующих возрастных групп: до 3 лет, от 3 до 10 лет, от 10 до 16 лет, от 16 до 50 лет, от 50 до 70 лет, свыше 70 лет.

Необходимо отметить, что для постановки реакций с помощью тест-системы ELI-N могут использоваться как все четыре упомянутых компонента (F-S100, F-GFAP, F-MP65, F-ФРН или сами белки S-100, GFAP, MP65, ФРН), так и отдельно взятые в любом сочетании. Кроме того, могут использоваться и другие нейроантигены или их иммунохимические аналоги.

Применение всех четырех предложенных компонентов тест-системы ELI-N позволяет более точно определить риск развития нервно-психических заболеваний по сравнению с использованием меньшего числа данных компонентов, но увеличивает стоимость анализа.

Положительный эффект от реализации изобретения сводится к получению тест-системы (диагностикума) ELI-N, с помощью которого можно выявить лица, сыворотки которых содержат аномальные уровни аутоантител к нейроантигенам, что является признаком повышенного риска развития нервно-психических заболеваний (или его наличия).

Необходимо отметить, что выполнение анализов производится в условиях in vitro без какого-либо вреда для обследуемого (примеры 1 - 4 см. в конце описания).

Технико-экономическая и социальная значимость
1. Применение диагностикума ELI-N для обследования детей раннего возраста с целью выявления лиц, имеющих повышенный риск нарушений развития нервной системы, позволит значительно снизить риск формирования психически и неврологически нездоровых детей.

2. При обследовании взрослых с помощью заявленного диагностикума с целью выявления лиц, имеющих риск нарушений развития нервной системы, позволит провести профилактические мероприятия, снижающие вероятность возникновения тяжелых заболеваний нервной системы в будущем.

3. Выполнение исследования производится на основе иммуноферментного анализа в условиях "ин витро", требует 10 мкл крови тестируемого лица и безопасно для пациента.

4. Получение реагентов не требует сложной и дорогостоящей аппаратуры и реактивов, а проведение процедур анализа может проводиться оператором-лаборантом.

Изобретение относится к области медицины, в частности к биотехнологии, иммунологии, психиатрии и неврологии. Образцы сыворотки крови обследуемых тестируются с помощью иммуноферментного анализа на планшетах, покрытых сорбируемыми компонентами тест-системы ELI-N, а именно F(ab)₂ - фрагментами антиидиотипических антител, специфически связывающих аутоантитела с направленностью к антигенам нервной ткани (аналоги антигенов) или самими антигенами нервной ткани, например а) белком S 100, б) белком GFAP, в) белком МР65, г) белком ФРН. В ходе тестирования выявляют лица, содержащие измененные (повышенные или пониженные по сравнению с образцами сыворотки здоровых лиц аналогичной возрастной группы) уровни аутоантител, взаимодействующих с перечисленными компонентами, что является характерным иммунологическим признаком нарушений в деятельности нервной системы, которые в дальнейшем будут проявляться на физиологическом уровне (или уже проявляются на момент обследования). Способ обеспечивает высокую точность определения и проведение массовых диспансерных обследований, направленных на выявление лиц, имеющих характерные изменения гуморального иммунитета и относящихся к группам повышенного риска развития нервно-психических заболеваний. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения степени риска развития нервно-психических заболеваний, включающий забор крови, получение сыворотки, получение тест-системы ELI-N (аналогов антигенов нервной ткани), проведение иммуноферментного анализа (ИФА) и скрининг пациентов по уровню определяемых аутоантител, отличающийся тем, что определяют с помощью ИФА иммунореактивность сывороточных антител к F(ab)₂-фрагментам антиидиотипических антител, специфически связывающих антитела с направленностью к антигенам нервной ткани, и при получении данных об отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений по степени выраженности отклонений определяют степень риска развития нервно-психических заболеваний, исходя из данных "Таблицы прогноза", полученной по результатам клинических наблюдений. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аналогов антигенов нервной ткани используют, например, F(ab)₂-фрагменты антиидиотипических антител, специфически связывающие антитела с направленностью к антигенам нервной ткани S100, GFAP, МР65, ФРН. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммунореактивность сывороточных антител определяют непосредственно к антигенам нервной ткани.