СПОСОБ СКРИННИНГОВОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИЦ ГРУППЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИИ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И МОНИТОРИНГА ЗА СОСТОЯНИЕМ БОЛЬНЫХ, СТРАДАЮЩИХ НЕРВНО-ПСИХИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение при скриннинге нервно-психических заболеваний.

Известно, что вызванные разными внешними или внутренними причинами сбои в механизмах иммунорегуляции, в том числе врожденные, могут сопровождаться нарушениями формирования и функционального созревания нервной системы ребенка или развитием нарушений в деятельности нервной системы взрослого человека (В.В.Абрамов, Взаимодействие нервной и иммунной систем. Новосибирск, Наука, 1988; А.Б.Полетаев и др., Нейроиммунология, 2003, 1,1, 11-20).

Иммунная система здорового человека постоянно продуцирует естественные регуляторные аутоантитела (е-аАТ) к любым антигенным компонентам собственного организма, в том числе, е-аАТ к компонентам нервных клеток или нейротропные е-аАТ (Полетаев А.Б. и др., Регуляторная метасистема, М.: Медицина, 2002). Синтез е-аАТ в здоровом организме поддерживается в определенных границах, необходимых для выполнения последними определенных регуляторных функций, а их избыточная, равно как и недостаточная продукция могут вести к развитию патологических состояний, в том числе, затрагивающих формирование и/или деятельность нервной системы.

Известен способ определения степени риска развития нервно-психических заболеваний путем определения с помощью иммуноферментного анализа иммунореактивности сывороточных антител к Р(ab)₂-фрагментом антиидиотипических антител, специфически связывающих антитела к антигенам нервной ткани и при получении данных об отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений и по степени выраженности отклонений определяют степень риска развития нервно-психических заболеваний, исходя из данных "Таблицы прогноза", полученной по результатам клинических наблюдений (патент РФ №2147128, зарегистрирован 27.03.2000 "Способ скриннинга нервно-психических заболеваний" авторы: Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Клюшник Т.П., Будыкина Т.С., Выбищевич Н.К., Гнеденко Б.Б.). В качестве антигенов нервной ткани используют Р(аb)₂-фрагментом антиидиотипических антител, специфически связывающих антитела с направленностью к антигенам нервной ткани S100, GFAP, MP65, NGF. Недостатком известного способа является его сравнительно невысокая точность. Во-первых, он позволяет оценивать содержание е-аАТ лишь к четырем белковым компонентам нервных клеток (белки S100, GFAP, МР-65 и NGF). Соответствующие изменениям частот, но не всегда, являются характерным признаком нервно-психических заболеваний.

Во-вторых, он позволяет регистрировать патологические изменения в сывороточном содержании лишь е-аАТ первого порядка (идиотипических). Этого недостаточно для суждения о давности патологического процесса и стадии его развития.

Задачей изобретения является повышение точности способа.

Поставленная задача решается тем, что дополнительно определяют иммунореактивность сывороточных антител к F(ab)-фрагментам нейромедиаторов нервной системы ГАМК, глутамату, дофамину, серотонину и их антиген-связывающим фрагментам или молекулам идиотипических антител к указанным нейромедиаторам и при отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений до степени выраженности отклонений определяют уровень риска нарушений развития нервной системы у детей, риска возникновения патологических изменений в деятельности нервной системы у взрослых лиц, а по соотношениям парных идиотипических/антиидиотипических антител судят о давности и динамике развития патологического процесса.

Способ по изобретению позволяет:

1. Регистрировать патологические изменения в сывороточном содержании е-аАТ, взаимодействующих как с белками нервных клеток (белки S100, GFAP, МВР), так и с главным белком миелиновой оболочки нервных волокон (белок NGF), а также е-аАТ, взаимодействующих с основными нейромедиаторами нервной системы (ГАМК, глутамин, дофамин, серотонин), и е-аАТ, взаимодействующих с мембранными рецепторами перечисленных нейромедиаторов.

2. Регистрировать патологические изменения в сывороточном содержании перечисленных выше е-аАТ первого порядка (идиотипов), равно как и е-аАТ второго порядка (специфических анти-антител; антиидиотипических антител).

Все это существенно расширяет спектр детектируемых форм патологии нервной системы и позволяет надежно судить о динамике и стадии развития патологического процесса в нервной ткани и давности заболевания.

Практически способ осуществляют следующим образом.

В результате сорбции на стандартные 96-луночные полистироловые планшеты для ИФА а) антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул антиидиотипических антител-иммунохимических аналогов эпитопов белков S100, GFAP, МВР и NGF; б) антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул идиотипических антител; в) конъюгатов молекул нейромедиаторов - ГАМК, глутамата, серотонина, дофамина, используемых для оценки содержания соответствующих антимедиаторных антител первого порядка; г) антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул идиотипических антител к указанным нейромедиаторам, используемых для оценки содержания соответствующих антител второго порядка, одновременно являющихся антителами к рецепторам соответствующих нейромедиаторов.

I. Нанесения на них тестируемых проб сывороток и эталонной референс-сыворотки, полученной от здоровых лиц.

II. Выявлении образующихся антиген-антительных комплексов с помощью конъюгатов вторичных (антивидовых) иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена или иным ферментом.

III. IV. Проявления реакции в лунках планшета с помощью субстрата-хромогена.

IV. Сравнения интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими референс-сыворотку.

Для проведения анализа ЭЛИ-Н-Тест требуется около 0,03 мл сыворотки крови обследуемого (например, полученной из подушечки пальца).

ПОЛУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕСТ-СИСТЕМЕ ЭЛИ-Н-ТЕСТ

1. Получение антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул-идиотипических антител к белкам S100, GFAP, MBP и NGF. Для получения данных компонентов тест-системы проводили иммунизацию кроликов белками S100, GFAP, MBP и NGF; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными белками S100, GFAP, MBP и NGF выделяли соответствующие идиотипические антитела (антитела первого порядка) и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)- или Р(ab)₂-фрагменты. Полученный материал (в виде антигенсвязывающих фрагментов или цельных молекул идиотипических антител (AT1)) использовался в работе.

2. Получение антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул антиидиотипических антител (АТ2) - иммунохимических аналогов эпитопов белков S100, GFAP, МВР и NGF. Для получения данных компонентов тест-системы проводили иммунизацию кроликов F(ab)₂-фрагментами поликлональных антител к соответствующим белкам; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колоннах с иммобилизованными поликлональными антителами к белкам S100, GFAP, MBP и NGF выделяли соответствующие антиидиотипические антитела и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)- или F(ab)₂-фрагменты. Полученный материал (в виде антигенсвязывающих фрагментов или цельных молекул антиидиотипических антител) использовался в работе.

3. Получение конъюгатов молекул нейромедиаторов - ГАМК, глутамата, серотонина, дофамина, используемых для оценки содержания соответствующих антимедиаторных антител первого порядка. Для получения данных компонентов тест-системы проводили ковалентную сшивку соответствующих нейромедиаторов с желатином, альбумином или иным макромолекулярным носителем. Полученный материал использовался в работе.

4. Получение антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул-идиотипических антител к нейромедиаторам ГАМК, глутамату, серотонину и дофамину. Для получения данных компонентов тест-системы проводили иммунизацию кроликов конъюгатами молекул нейромедиаторов - ГАМК, глутамата, серотонина, дофамина; из иммунной сыворотки с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными нейромедиаторами выделяли соответствующие идиотипические антитела (антитела первого порядка) и в результате протеолитической обработки получали их F(ab)- или F(ab)₂-фрагменты. Полученный материал (в виде антиген-связывающих фрагментов или цельных молекул идиотипических антител) использовался в работе.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ НЕПРЯМОГО ИФА

1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовят растворы каждого из компонентов тест-системы на карбонатном буфере рН 9-10. Приготовленные растворы вносят в отдельные лунки планшета. Планшеты инкубируют ночь при +2...+4°С.

2. Удаляют (стряхнуть) из лунок растворы компонентов и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0,15 М NaCl).

3. После инкубации отмывают планшеты отмывочным буфером (например, 0.15 М NaCl с 0.05% твин-20).

4. Внесение тестируемых сывороток:

а) в отдельных флаконах или ванночках или ИФА готовят разведения сывороток (например, 1:200) на отмывочном буфере.

б) вносят разведенные сыворотки в лунки.

в) планшеты инкубируют ночь при +4°С.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции:

а) исходный раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека разводят в необходимое число раз (в зависимости от его активности) отмывочным буфером; б) раствор конъюгата вносят во все лунки планшета; в) планшеты инкубируют 60-90 мин при 37°С, либо 12-16 час при +2...+4°С. Конъюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером; г) сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата-хромогена (например, 0.01-0.05% о-фенилендиамина с 0.001-0.01% перекиси водорода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 15-20 мин при комнатной температуре.

7. По достижении оптимального уровня окрашивания (обычно через 10-20 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М кислоты.

8. Регистрация результатов реакции: интенсивность окрашивания оценивают с помощью иммуноферментного анализатора (ИФА-ридера) любой модели.

9. Обработка полученных данных:

По полученным значениям оптической плотности лунок рассчитывают относительную интенсивность реакции тестировавшихся сывороток с каждым из компонентов тест-системы ИЛИ-Н-Тест по отношению к реакции контрольной сыворотки с тем же антигеном за минусом 100 единиц и выражают в условных единицах. Для расчета используют формулу

Обозначения:

R(ar1) - величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном - 1;

R(ar2) - величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном-2;...

R(arn) - величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном-n;

R(к1...кn) - величина оптической плотности контрольной сыворотки крови в лунках с антигенами 1...n.

10. Интерпретация полученных данных:

а) в случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки взрослых с любым из компонентов тест-системы не выходит за пределы от -25% до +15% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к 1-й классификационной группе или группе нормы (вероятность возникновения психо-невропатологии минимальна). Для новорожденных и детей до пубертата параметры нормы не выходят за пределы от -40% до 0;

б) в случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы группы 1, но не превышает отклонений от -40% до +40% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят ко 2-й классификационной группе или группе умеренных отклонений (малый/умеренный риск развития психоневропатологии). Для новорожденных и детей до пубертата параметры нормы не выходят за пределы от 60% до +10;

в) в случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы 1-й и 2-й групп, данную сыворотку относят к 3-й классификационной группе или группе выраженных отклонений (признаки наличия нервно-психического заболевания или высокий риск его развития);

г) вероятность благоприятного/неблагоприятного прогноза развития (нормального формирования) нервной системы у новорожденных и детей раннего возраста, так и в плане нормальной деятельности нервной системы прямо зависит от уровней нормы/отклонений от нормы, определяемых е-аАТ в сыворотке крови обследуемых, а частота аномалий в формировании и функционировании нервной системы прямо коррелирует с уровнем отклонений. Чем более выражены отклонения, тем выше риск возникновения аномалий функционально-морфологического развития нервной системы;

д) риск развития патологических изменений в нервной системе у взрослых лиц прямо коррелирует с уровнями отклонений от нормы, определяемых е-аАТ в сыворотке крови обследуемых. Чем более выражены отклонения, тем выше риск развития заболеваний центральной или периферической нервной системы;

3+-е) нормальные соотношения между идиотипическими и антиидиотипическими антителами (Индексы АТ1/АТ2) у любой из пар близки к 1,0 (должны укладываться в диапазон 0,8...1,2). Преимущественно повышенный уровень антител первого порядка (идиотипов) указывает на небольшую длительность (не более 1 мес) патологического процесса. Преимущественно повышенный уровень антител второго порядка (антиидиотипов) свидетельствует о давности (хронизации) патологического процесса (более 6 мес). По динамике изменений в соотношениях парных идиотипических и антиидиотипических е-аАТ можно судить как о нарастании негативных тенденций, так и о нормализации функций нервной системы, например на фоне эффективного лечения.

Необходимо отметить, что выполнение анализов производится в условиях in vitro без какого-либо вреда для обследуемого.

Изобретение относится к области медицины и касается способа скриннингового выявления лиц группы риска развития патологии нервной системы и мониторинга за состоянием больных, страдающих нервно-психическими заболеваниями. Способ включает забор крови, получение сыворотки, проведение иммуноферментного анализа для определения содержания антиидиотипических антител к антигенам нервной ткани и скрининг пациентов по уровню определяемых антител, в котором дополнительно определяют иммунореактивность идиотипических антител к ней ромедиатором нервной системы ГАМК, глутамину, дофамину, серотонину и к антигенам нервной ткани: белкам S100, GFAP, MBP и NGF и к рецепторам нейромедиаторов и по степени выраженности отклонений от нормы и соотношения идиотипических и антиидиотипических антител определяют уровень риска нарушений развития нервной системы. Преимущество изобретения заключается в возможности прогнозирования указанных нарушений до выраженных клинических изменений.

Способ выявления лиц группы риска развития патологии нервной системы, включающий получение сыворотки, проведение иммуноферментного анализа для выявления содержания антиидиотипических антител (антител второго порядка) к антигенам нервной ткани с последующим рассчётом показателей иммунореактивности и скрининг пациентов по уровню иммунореактивности, отличающийся тем, что определяют иммунореактивность как антиидиотипических (АТ2) так и идиотипических антител (AT1) к антигенам нервной ткани: белкам: S100, GFAP, МВР и NGF, а также к нейромедиаторам: ГАМК, глутамату, серотонину, дофамину и к рецепторам нейромедиаторов и по степени отклонения иммунореактивности от нормы в соотношениях идиотипических и антиидиотипических антител судят о риске развития патологии нервной системы.