СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОПИЙНОЙ НАРКОМАНИИ И ЕЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может найти применение в ходе скрининговых обследованиях для выявления лиц, страдающих опийной наркоманией.

Выявление лиц, злоупотребляющих наркотическими препаратами опийного ряда, такими как героин, морфин, опиум, имеет высокую социальную значимость, например, при профессиональном отборе кандидатов на должности, связанные с повышенной ответственностью и возможной опасностью для общества в случае психологической и поведенческой неадекватности соответствующего лица (силовые структуры, авиация, транспорт и др).

Известен способ диагностики опийной наркомании путем исследования биосубстратов обследуемого, таких как волосы ил биологических жидкостей, таких как моча, кровь, слюна (Karch S.B. Drug Abuse Handbook, 1998, p.113).

Недостатками указанного способа являются его сравнительно невысокая точность, обуславливаемая быстрым катаболизмом наркотиков в организме и невозможностью его определения спустя две недели после последнего приема, и сложность, связанная с длительностью выделения из биосубстрата и использования дорогостоящей техники, такой как хроматомасспектограф.

Задачей изобретения является повышение точности диагностики опийной наркомании, ее длительности и его упрощение, позволяющее проводить скрининговые обследования.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что определяют иммунореактивность сыворотки обследуемого, обусловленной антиопийными антителами и антигенспецифическими анти-антителами (антиидиотипами) в сравнении с нормальной сывороткой и при увеличении иммунореактивности, обусловленной антиопийными антителами или антигенспецифическими анти-антителами или к тем и другим более чем на 50% делают заключение об опийной наркомании, а при отношении первой иммунореактивности к иммунореактивности второй более 0,8 делают вывод о длительности наркомании более чем в течение 4-6 последних месяцев.

Наиболее предпочтительным является использование фрагментов вышеперечисленных антител и анти-антител /Fab и F (ab)₂/, полученные протеолитическим гидролизом антител или анти-антител.

Заявляемый способ базируется на использовании специфической иммунохимической детекции в сыворотке крови обследуемых существенного повышения уровней высокоаффинных идиотипических антител класса IgG, перекрестно реагирующих с морфином, героином и кодеином ("антиморфиновые" AT1), и соответствующих "анти-антиморфиновых" антител (антиидиотипические АИАТ2), а также на расчете в каждом конкретном случае Индекса АТ1/АТ2.

Из гипериммунных сывороток кроликов, либо иных животных, иммунизированных конъюгатом гаптен-носитель (в качестве гаптена используют морфин или иной препарат опийного ряда; в качестве носителя - БСА, гемоцианин или иной белок) выделяют антиморфиновые антитела AT1, используя иммуносорбцию на колонке с морфином или героином, иммобилизованным на любом инертном носителе (например, эпоксиактивированной-сефарозе). Для этого на иммуноаффинную колонку наносят пробу гипериммунной сыворотки, отмывают колонку от несвязавшегося материала 0,1-0,3 М NaCl с добавками тритона Х-100 или иного неионного детергента и элюируют специфически связавшиеся AT1, нанося на колонку раствор, вызывающий диссоциацию антиген-антительных комплексов (например, раствор 3-4 М KSCN). Полученные AT1 диализуют против избытка 0,05 М ацетатного буфера рН 4,5 и подвергают протеолитическому гидролизу для получения их Fab или F(аb)₂ - фрагментов (например, пепсином, взятым в соотношениях AT: пепсин 50-100: 1; инкубация 24-48 ч при 37^oС). Для выделения и выявления АИАТ2 допустимо использовать цельные AT1, что, однако, сопровождается значительным усилением неспецифического фонового окрашивания и затрудняет интерпретацию результатов.

Полученные Fab или F(аb)₂ - фрагменты AT1 (или цельные AT1) используют для выделения и выявления "анти-антиморфиновых" (антиидиотипических) АИАТ2. Для этого полученные Fab или F(ab)₂ - фрагменты AT1 иммобилизуют на любом инертном носителе и используют для иммуноаффинного выделения АИАТ2 из гипериммунной сыворотки, как описано выше. Полученные АИАТ2 диализуют против избытка 0,05 М ацетатного буфера рН 4,5, подвергают протеолитическому гидролизу для получения их Fab или F(аb)₂ - фрагментов и, в свою очередь, используют для выявления AT1 в сыворотках обследуемых. Допустимо использовать цельные АИАТ2, однако, это сопровождается значительным усилением фонового окрашивания и затрудняет интерпретацию результатов.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ НЕПРЯМОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ "АНТИМОРФИНОВЫХ" АНТИТЕЛ (AT1) И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (АИАТ2)
Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовят растворы полученных AT1 и "анти-антиморфиновых" антиидиотипических) АИАТ2 или их Fab или F(аb)₂ - фрагментов на карбонатном буфере. Приготовленные растворы вносят в отдельные лунки планшета. Накрытые крышками планшеты инкубируют ночь при +2...4^oС или 2 ч при 40^oС.

Удаляют из лунок растворы белков и заливают в них блокирующий буфер (например, 0,5%-ный раствор желатина на 0,15 М NaCl). Инкубируют 1 ч при 37^oС.

Отмывают планшеты отмывочным буфером (0,15 М NaCl с 0,05% твин-20).

Внесение тестируемых сывороток.

а) Готовят разведения сывороток обследуемых лиц (1:100...1000) на отмывочном буфере.

б) Вносят разведенные сыворотки в лунки.

в) Планшеты инкубируют ночь при +2...4^oС.

Отмывают планшеты отмывочным буфером.

Проявление реакции:
а) исходный раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека разводят в 25 необходимое число раз (в зависимости от его активности) отмывочным буфером;
б) раствор конъюгата вносят во все лунки планшета;
в) планшеты инкубируют 60-90 мин при 37^oС либо 12-16 ч при +2...4^oС. Коньюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером;
г) сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0,01-0,05% о-фенилендиамина с 0,001-0,01% перекиси водовода на 0,01-0,05 М цитрат-фосфатном буфере рН 4,5-5 в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 15-20 мин при комнатной температуре.

По достижении оптимального уровня окрашивания (через 10-20 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0,1-0,2 М кислоты.

Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели. Из нескольких (обычно трех) дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной (референс-сыворотка) и тестируемых сывороток выбирают среднее (в случае, если из 3 дублей один сильно отличается от двух других, т.е. является заведомо артефактом, его значение не принимают в расчет). По значениям оптической плотности лунок, количественно рассчитывают относительную интенсивность реакции AT1 и "анти-антиморфиновых" (антиидиотипических) АИАТ2 тестировавшихся сывороток по отношению к реакции референс-сыворотки.

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с иммобилизованными AT1 или АИАТ2 (или их фрагментами) не выходит за пределы +20% по отношению к реакции референс-сыворотки (эталона), данного индивида относят к лицам, не злоупотребляющим наркотиками опийного ряда.

Если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с иммобилизованными AT1 или АИАТ2 (или их фрагментами) находится в диапазоне +20...+50% по отношению к реакции сыворотки-эталона, соответствующего индивида относят к лицам, возможно употребляющих соответствующие наркотические препараты эпизодически или переставшего их потреблять более 6 мес. назад.

Если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с иммобилизованными AT1 или АИАТ2 (или их фрагментами) выходит за предел +50%, это служит указанием на то, что сыворотка получена от лица, регулярно и длительно употребляющего соответствующие наркотические препараты.

Эмпирические данные, полученные при анализе ряда клинических случаев, позволили выявить следующие закономерности.

- Содержание антител AT1, способных связывать препараты опийного ряда и соответствующих "анти-антиморфиновых" (антиидиотипических) АИАТ2 в сыворотке крови здорового человека, не употреблявшего соответствующие наркотические прапараты, относительно постоянно и уровень их иммунореактивности не превышает +20% по отношению к реакции референс-сыворотки. При этом Индекс иммунореактивности АТ1/АИАТ2 находится в пределах 0,8-1,0. Указанный Индекс рассчитывают по формуле:
Инд=(100+Иммунореактивность AT1)/(100+Иммунореактивность АИАТ2)
- Регулярное и длительное (более 4-6 мес.) употребление наркотических препаратов опийного ряда ведет к росту сывороточного содержания AT1 и АИАТ2 и увеличению их иммунореактивности до 100% и более от контроля.

- Относительно недавнее (месяцы) начало употребления наркотиков сопровождается преимущественным ростом сывороточного содержания AT1; при этом значения Индекса иммунореактивности АТ1/АИАТ2 оказываются ниже значений 0,8. В дальнейшем наблюдается повышение продукции как AT1, так и АИАТ2, что указывает на относительную давность (более полугода) злоупотребления соответствующими наркотическими препаратами.

Изобретение относится к области медицины, в частности к наркологии, и может быть использовано для выявления лиц, страдающих опийной наркоманией. Сущность способа состоит в том, что определяют иммунореактивность сыворотки обследуемого, обусловленной антиопийными антителами и антигенспецифическими антиантителами в сравнении с нормальной сывороткой и при увеличении иммунореактивности, обусловленной антиопийными антителами или антигенспецифическими антиантителами, или той и другой, более чем на 50% делают заключение об опийной наркомании, а при отношении первой иммунореактивности к иммунореактивности второй более 0,8 делают вывод о длительности наркомании более чем в течение 4-6 последних месяцев. Техническим результатом является упрощение и повышение точности диагностики опийной наркомании, а также возможность определения ее длительности. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ диагностики опийной наркомании и ее длительности путем исследования биологической жидкости, отличающийся тем, что определяют иммунореактивность сыворотки обследуемого, обусловленной антиопийными антителами и антигенспецифическими антиантителами в сравнении с нормальной сывороткой и при увеличении иммунореактивности, обусловленной антиопийными антителами, или антигенспецифическими антиантителами, или той и другой более чем на 50% делают заключение об опийной наркомании, а при отношении первой иммунореактивности к иммунореактивности второй более 0,8 делают вывод о длительности наркомании более чем в течение 4-6 последних месяцев.2. Способ по п.1 отличающийся тем, что в качестве опийных антител и антигенспецифических антиантител используют их фрагменты, полученные их протеолитическим гидролизом.