ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИНОЙ ГИБРИДОМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЯДРЫШКОВОМУ АНТИГЕНУ, АССОЦИИРОВАННОМУ С КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИЕЙ Российский патент 2000 года по МПК C12N5/12 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и касается штамма клеток машиной гибридомы, секретирующих моноклональные антитела, пригодные для идентификации пролиферирующих клеток посредством выявления экспрессируемого ими антигена полученным реагентом.

Степень злокачественности, а значит пролиферативная активность клона опухолевых клеток, является одним из основных критериев, используемых для диагностики гематологических неоплазий. Определение этого параметра дает возможность подбирать адекватную терапию, оценивать индивидуальные особенности течения болезни и прогнозировать продолжительность жизни пациента.

Для оценки пролиферации клеточной популяции применяют различные методы: 1) авторадиографии с использованием тимидина, меченного тритием, 2) проточной цитометрии с подсчетом содержания ДНК, 3) иммуноцитохимический с использованием моноклональных антител к антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией. При сравнении вышеперечисленных методов было показано, что последний является наиболее предпочтительным, так как позволяет выявлять пролиферацию клеток на более ранних стадиях клеточного цикла, чем остальные, которые также уступают ему в чувствительности и воспроизводимости [1]. Кроме того, он прост в исполнении, и, что очень важно, не связан с использованием радиоактивных веществ и сложного оборудования.

За рубежом получен ряд моноклональных антител, направленных к ядерным антигенам, экспрессирующимся в различные фазы клеточного цикла. Наиболее распространены и имеют клиническое применение антитела K_i-67 (Дания) [2], маркирующие антиген, который определяется в пролиферирующих клетках, начиная от поздней G₁ фазы и заканчивая фазой митоза. Данный антиген в покоящихся клетках не выявляется. Применение моноклональных антител K_i-67 в иммуногистохимических исследованиях позволяет оценивать ростовую фракцию клона опухолевых клеток.

Отечественные реагенты подобной направленности отсутствуют.

Целью изобретения явилось создание штамма культивируемых гибридомных клеток, полученных в системе мышь х мышь, секретирующих моноклональные антитела к ядерному антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией.

Для осуществления этого применяли метод соматической гибридизации клеток. В качестве иммуногена использовали ядерную фракцию лизированных в 0,1% растворе Nonidet P-40 клеток B-лимфобластоидной линии Daudi, находящейся в логарифмической фазе роста. Это обеспечивало наличие максимального количества активно пролиферирующих клеток, экспрессирующих искомые антигены. Мышей линии BALB/с трехкратно иммунизировали, а затем их сенсибилизированные спленоциты сливали с культивируемыми клетками мышиной миеломы в соотношении 3:1. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3000 - 3700. Объединенные после процедуры слияния клетки культивировали в 96-луночных плоскодонных платах по 0,2•10⁶ клеток на ячейку в среде с селективными агентами (50-кратным концентратом гипоксантинааминоптерина-тимидина). Скрининг культуральных жидкостей из лунок, давших рост гибридомным клонам, проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции на фиксированных клетках линии Daudi.

Гибридомные клетки, секретирующие моноклональные антитела, связывающиеся с ядерными структурами пролиферирующих клеток и не взаимодействующие с покоящимися клетками, шестикратно клонировали методом лимитирующих разведений и затем выводили в массовую культуру. Для получения высоких концентраций моноклональных антител, названных BCA-PC, штамм клеток 3С9 выращивали в виде асцитной опухоли в брюшной полости мышей (DBAxBALB/c)F₁ с предварительным введением пристана и облучением в дозе 400 Рад.

Штамм 3С9 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты, слабо прикрепляющиеся к пластику.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - DMEM, с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 2% HEPES-буфера, 50 мкг/мл гентамицина и 5•10^-5 M 2-меркаптоэтанола. Условия культивирования - 37^oC, абсолютная влажность и 5% CO₂ в воздухе. Частота пассирования 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10. Титр антител в культуральной жидкости в реакции непрямой иммунофлюоресценции определяется как 1:10-1:100.

Титр моноклональных антител в асцитной жидкости мышей составляет 1: 500-1:1000.

Характеристика моноклональных антител. Моноклональные антитела BCA-PC, секретируемые штаммом 3С9, относятся к иммуноглобулину класса M.

Способ криоконсервирования штамма клеток 3С9. Криозащитная среда: DMEM, содержащая 40% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Криоампулы с клеточной взвесью помещают на сутки в холодильник на -70^oC, после чего переносят в жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания - 90% - 95%. После размораживания клетки культивируют в плотности 0,2 - 0,3•10⁶ кл/мл.

Бактерии, грибы и дрожжи в культуре не обнаружены.

Специфичность MKA BCA-PC.

Моноклональные антитела BCA-PC выявляют ядрышковый антиген клеток растущих клеточных культур различного видового, тканевого и линейного происхождения, ФГА - стимулированными лимфоцитами здорового донора, пролиферирующими клетками больных различными гематологическими заболеваниями и не взаимодействуют с покоящимися клетками.

Антитела BCA-PC маркируют антиген, который локализован в ядрышках интерфазных клеток и в цитоплазме митозных клеток.

При определении молекулярной массы антигена, связываемого полученными антителами, методом Вестерн - блоттинга, было выявлено две полосы, соответствующие 35 кД и 42 кД. При изучении литературных данных, ссылок на получение моноклональных антител к ядрышковому антигену, обладающему сходной характеристикой, обнаружено не было.

Сравнительное изучение реактивности моноклональных антител BCA-PC и K_i-67 (Дания) с клетками больных различными гематологическими заболеваниями показало, что более, чем в половине случае, результаты сходные, а в остальных случаях процент K_i-67 меченых клеток был либо выше, либо ниже процента BCA-PC - меченых клеток.

Таким образом, моноклональные антитела BCA-PC могут быть рекомендованы в качестве реагента, используемого в дополнение к существующей в нашей стране диагностической панели моноклональных антител для иммунофенотипирования клеток больных лейкозами и лимфонами, позволяющего оценивать пролиферативную активность патологических клеток. Также полученный препарат может служить инструментом для изучения процесса клеточного деления в фундаментальных исследованиях.

Литература
1. Dufay N., Touraine F., Louvier C et al. Lymphocyte proliferation analysis by flow cytometry. //Biol. Cell., 1991. - V. 73. - P. 28.

2. Gerdes J., Schwab U., Lemke H. et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. //Int. J. Cancer, 1983. - V. 31. - P. 13 - 20.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для идентификации пролиферирующих клеток. Гибридому получают путем слияния спленоцитов мышей, иммунизированных ядерной фракцией клеток β-лимфобластоидной линии Daudi, с клетками мышечной миеломы. Гибридома секретирует моноклональные антитела, направленные к ядрышковому антигену с мол. м. 35 и 43 кD, выявляемому в пролиферирующих клетках различной видовой, тканевой и линейной принадлежности. Изобретение позволяет изучать процесс клеточной пролиферации при злокачественных заболеваниях.

Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы ЗС9, используемый для получения моноклональных антител и ядрышковому антигену с мол.м. 35 и 43 кD, выявляемому в пролиферирующих клетках различной видовой, тканевой и линейной принадлежности.