Способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

1 13

Изобретение относится к медицине, а именно к цитологии.

Цель изобретения - повьшение выхода клеток с высокой тестостеронсинте- зирующей активностью благодаря использованию эмбриональной ткани семенников человека 14-24-недельного возраста, возможности селективного выделения клеток Лейдига с помощью фермента коллалитина, дезагрегации ткани в охлажденной среде с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скотао

Способ осуществляют следующим образом.

Семенники извлекают у плодов 14-24-недельного возраста на уровне повздошной ямки или в брюшной части пахового кольца стерильно и помещают во флакон с Хенксом с добавлением антибиотиков (канацимин). После многократной промывки органов Хенксом удаляют соединительную наружную оболочку. Содержимое белочной оболочки выдавливают пинцетом, мелко расстригают и заливают дезагрегирующей сме- сьи. Диспергирующая смесь состоит из Версена и отечественного фермента коллалитина (на 100 мл Версена 25 мг раствора коллалитина) . Ткань со смесью помещают в термостат при 37 С и инкубируют 10 мин, после чего осторожно удаляют дезагрегирующую смесь, а кусочки ткани семенников заливают охлажденной средой 199 с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и помещают на магнитную мешалку. Отмывание ведут при 4- 10°С;, Экстракты собирают до полного истощения ткани. Клетки осаждают ,. центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадок удаляют, а клетки ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из равных объемов сре 199 и гидролизата лактальбумина с 20%-ной сывороткой крупного рогатого скота. Культивирование проводят при 37 С при посевной дозе 800 тыс,кл/мл Тестостеронсинтезирующую активность клеток Лейдига семенников определяют в экстрактах растущих культур радиоизотопным методом.

Пример 1, В качестве источника получения клеток Лейдига семенников используют эмбриональную ткань семенников человека 14-недельного возраста. Дезагрегацию предварительно измельченной ткани проводят смесью, состоящей из отечественного коллалитина С Версеном (на 100 мл Вер52

сена 23 мг 0, раствора колла-. итипа), Ткань, залитую дезагрегирующей смесью, помещают в термостат при 37 С на 10 мин. После удаления

дезагрегирующей смеси диспергирование ткани проводят на магнитной мешалке в среде 199 с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота до полного истощения ткани. Осажденные

центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин клетки ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из разных объемов среды 199 и гидролизата лактальбумина с добавлением

20%-ной сыворотки крупного рогатого скота. Рассев клеток проводят при посевной дозе 800 тыс. кл./мл по 2 мл во ф.паконы и культивируют при 37 С. Через 24 ч отмечают прикрепление,

распластывание и рост эмбриональных клеток Лейдига семенников человека. Через 48 ч отмечают формирование монослоя, К этому времени монослой состоит в основном из клеток иолигонального типа, плотно прилегающих друг к другу. Цитоплазма этих клеток богата мелкозернистым материалом и вакуольными включениями, положительно окрашивающимися судановыми красите-

лями. Размер и форма клеток, ядер вариабельны.

Уровень определяемого в экстрактах тестостерона достигает 1,8 нг/мл,

П р и м е р 2. Для получения монослоя клеток Лейдига используют ткань 24-недельного плода человека. Дезагрегацию предварительно измельченной ткани проводят смесью (на

100 мл Версена 23 мг 0,2%-ного раствора коллалитина). Ткань, залитую дезагрегирующей смесью, помещают в термостат при 37 С на 10 мин. После удаления дезагрегирующей смеси диспергирование ткани проводят на магнитной мешалке в среде 199 с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота до полного истощения ткани. Осажден- ; ные центрифугированием при 1000 об/мин

в течение 10 мин клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды, состоящей из. равных объемов среды 199 и гидролизата лактальбумина с добавлением 20%-ной сыворотки крупного рогатого

скота, и засеивают во флакон емкостью 100 мл. Посевная доза 800 тыс,кл./мл, .Формирование полного монослоя отмечают через 48 ч. Монослой представлен однородными клетками полигонального

типа. Уровень тестостерона в тах достигал 8 нг/мл, , Использование способа получения культуры эмбриональных клеток Лейди- га обеспечивает 100% эффект получения однородных культур клеток Лейдига из семенников 14-24-недельных плодов человека.

13173054

экстрак- мента в среде 199 с последующим культивированием в составе, содержащем среду 199, гидролизат лактабульмина и сыворотку крупного рогатого .скота

отличающиися тем, что, с целью повышения выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью, используют семенники человека 14-24-недельного возраста, при fO этом дезагрегацию проводят в раство-

Формула изобретения Способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига путем измельчения ткани семенника, ее дезагрегации в растворе Версена с цротеолитиотличающиися тем, ч целью повышения выхода клеток с кой тестостеронсинтезирующей ак ностью, используют семенники че ка 14-24-недельного возраста, п fO этом дезагрегацию проводят в ра

ре Версена дополнительно содерж -0,2%-ный раствор коллалитина, а вание ведут при 4-10°С в среде, полнительно содержащей 2%-ную с

ческими ферментами, отмывание от фер-t5 ротку крупного рогатого скота.

Редактор В, Ковтун

Составитель М, Позняк

Техред Л.Олейник Корректор Е. Рошко

Заказ 2414/37 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

.по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

отличающиися тем, что, с целью повышения выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью, используют семенники человека 14-24-недельного возраста, при этом дезагрегацию проводят в раство- .

ре Версена дополнительно содержащем 0,2%-ный раствор коллалитина, а отмывание ведут при 4-10°С в среде, дополнительно содержащей 2%-ную сыво

Изобретение относится к медицине, точнее к цитологии. Цель изобретения - повьшение выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью путем Использования эмбриональной ткани семенников человека 14-24-недельного возраста, селективного вьщеления клеток Лейдига с помощью фермента коллатилина, дезагрегации ткани в охлажденной среде с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота. Тестостеронсинтезирующую активность клеток Лейдинга семенников определяют в экстрактах растущих культур радиоизотопным методом. с со со