Изобретение относится к ферментативным нуклеиновым (НК) кислотам, которые способны расщеплять последовательности нуклеиновых кислот. Последовательности ферментативных нуклеиновых кислот приведены в описании. Композиция, расщепляющая НК, содержит каталитическую ДНК. Расщепление фосфоэфирной связи в субстрате получают при смешивании молекулы каталитической ДНК с субстратом, содержащим такую связь, и последующей выдержке смеси. Затем молекулы каталитической ДНК отделяют от продуктов каталитической реакции. Селекцию молекул каталитической ДНК проводят смешиванием однонитевых молекул каталитической ДНК с нуклеотидсодержащими субстратными молекулами с последующей выдержкой и разделением. Изобретение позволяет получать молекулы каталитической ДНК, обладающей субстратспецифической эндонуклеазной (ферментативной)активностью. 10 с. и 56 з.п.ф-лы, 11 ил., 3 табл.
1. Молекула каталитической ДНК, обладающая сайтспецифической эндонуклеазной активностью, где указанная молекула каталитической ДНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21 и SEQ ID N° 22.2. Молекула каталитической ДНК по п.1, где указанная эндонуклеазная активность увеличивается в присутствии Мg+2.3. Молекула каталитической ДНК по п.1, где указанная эндонуклеазная активность увеличивается в присутствии катиона, выбранного из группы, состоящей из Рb+2, Mn+2, Zn+2, Са+2, Na+ и К+.4. Молекула каталитической ДНК, обладающая сайтспецифической эндонуклеазной активностью, где указанная молекула каталитической ДНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38 и SEQ ID N° 39.5. Молекула каталитической ДНК по п.4, где указанная эндонуклеазная активность увеличивается в присутствии Мg+2.6. Молекула каталитической ДНК по п.4, где указанная эндонуклеазная активность увеличивается в присутствии катиона, выбранного из группы, состоящей из Рb+2, Mn+2, Zn+2, Са+2, Na+ и К+.7. Молекула каталитической ДНК, обладающей сайтспецифической эндонуклеазной активностью, которая специфически расщепляет нуклеотидсодержащую молекулу субстрата, по определенному сайту расщепления, полученная по способу, включающему стадии: а) смешивание совокупности однонитевых молекул ДНК с нуклеотидсодержащими молекулами субстрата с образованием смеси; б) выдерживание указанной смеси в течение периода времени и в заранее определенных условиях реакции, достаточных для расщепления указанных молекул субстрата до продуктов расщепления с помощью однонитевых молекул ДНК и в) выделение из совокупности нуклеиновых кислот однонитевых молекул ДНК, которые расщепляют указанные молекулы субстрата.8. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что сайт расщепления содержит однонитевую нуклеиновую кислоту.9. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что указанный субстрат содержит РНК, ДНК, модифицированную РНК, модифицированную ДНК, аналог нуклеотида или их смесь.10. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она катализирует гидролитическое расщепление фосфоэфирной связи по указанному сайту расщепления.11. Молекула каталитической ДНК по п.10, отличающаяся тем, что гидролитическое расщепление дополнительно увеличено в присутствии одновалентного или двухвалентного катиона.12. Молекула каталитической ДНК по п.11, отличающаяся тем, что катион выбирают из группы, состоящей из группы, состоящей из Рb+2, Mn+2, Zn+2, Са+2, Na+ и К+.13. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она является однонитевой молекулой ДНК.14. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что указанная субстратная нуклеиновая кислота присоединена к указанной молекуле каталитической ДНК.15. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она обладает сродством связывания субстрата не более 1 мкМ.16. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она связывает субстрат с КD не более 0,1 мкМ.17. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она включает консервативное ядро, содержащее одну или более консервативную нуклеотидную последовательность.18. Молекула каталитической ДНК по п.17, отличающаяся тем, что указанная одна или более консервативная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из СG, CGA, AGCG, AGCCG, CAGCGAT, CTTGTTT и СТТАТТТ.19. Молекула каталитической ДНК по п.17, отличающаяся тем, что указанное консервативное ядро включает, по крайней мере, две консервативные нуклеотидные последовательности и указанная молекула каталитической ДНК дополнительно содержит один или более вариабельный или спенсерный нуклеотид, вставленный между указанными консервативными нуклеотидными последовательностями указанного консервативного ядра.20. Молекула каталитической ДНК по п.17, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, связывающих субстрат.21. Молекула каталитической ДНК по п.20, отличающаяся тем, что одна или более нуклеотидная последовательность, связывающая субстрат, фланкирует указанное консервативное нуклеотидное ядро.22. Молекула каталитической ДНК по п.20, отличающаяся тем, что одна или более нуклеотидная последовательность, связывающая субстрат, выбрана из группы, содержащей
САТСТСТ,
GCTCT,
ТТGСТТТТТ,
TGTCTTCTC,
TTGCTGCT,
GCCATGCTTT (SEQ ID N° 19, остатки 5-14),
CTCTATTTCT (SEQ ID N° 20, остатки 10-19),
GTCGGCA,
CATCTCTTC и
ACTTCT.
23. Молекула каталитической ДНК по п.20, отличающаяся тем, что указанная одна или более нуклеотидная последовательность, связывающая субстрат, выбрана из группы, состоящей из:TATGTGACGCTA (SEQ ID N° 14, остатки 28-39),
TATAGTCGTA (SEQ ID N° 15, остатки 41-50),
ATAGCGTATTA (SEQ ID N° 16, остатки 40-50),
ATAGTTACGTCAT (SEQ ID 17, остатки 27-39),
AATAGTGAAGTGTT (SEQ ID N° 18, остатки 28-41),
TATAGTGTA,
ATAGTCGGT,
ATAGGCCCGGT (SEQ ID N° 21, остатки 40-50),
AATAGTGAGGCTTG (SEQ ID N° 22, остатки 36-49) и
ATGNTG.
24. Молекула каталитической ДНК по п.20, отличающаяся тем, что указанная одна или более нуклеотидная последовательность, связывающая субстрат, выбрана из группы, состоящей из TGTT, TGTTA и TGTTAG.25. Молекула каталитической ДНК по п.20, которая дополнительно содержит один или более вариабельный или спенсерный нуклеотид, который а) вставлен между указанным консервативным ядром и расположенной рядом (смежной) нуклеотидной последовательностью, связывающей субстрат, или б) вставлен между консервативными нуклеотидными последовательностями в указанном консервативном ядре, или в) вставлен между смежными нуклеотидными последовательностями, связывающими субстрат, или г) расположен на любом или обоих концах указанной молекулы каталитической ДНК, или д) в любой комбинации а), б), в) и г).26. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она включает одну или более структур типа ″шпилки″.27. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 52–101.28. Молекула каталитической ДНК по п.27, отличающаяся тем, что указанная эндонуклеазная активность увеличивается в присутствии Мg+2.29. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она увеличивается в присутствии двухвалентного катиона.30. Молекула каталитической ДНК по п.29, отличающаяся тем, что указанный двухвалентный катион выбирают из группы, состоящей из Рb+2, Mg+2, Mn+2, Zn+2, Са+2.31. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что указанная эндонуклеазная активность увеличивается в присутствии одновалентного катиона.32. Молекула каталитической ДНК по п.31, отличающаяся тем, что указанный одновалентный катион выбиран из группы, состоящей из Na+ и К+.33. Молекула каталитической ДНК по п.7, отличающаяся тем, что она содержит консервативное ядро, фланкированное первой и второй областями связывания субстрата, и один или более спейсерный нуклеотид находится между указанным консервативным ядром и указанной областью связывания субстрата.34. Молекула каталитической ДНК по п.33, отличающаяся тем, что указанное консервативное ядро содержит одну или более консервативную область.35. Молекула каталитической ДНК по п.33, отличающаяся тем, что указанная первая область связывания субстрата включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей:САТСТСТ,
GCTCT,
ТТGСТТТТТ,
TGTCTTCTC,
TTGCTGCT,
GCCATGCTTT (SEQ ID N° 40),
CTCTATTTCT (SEQ ID N° 41),
GTCGGCA,
CATCTCTTC и
ACTTCT.
36. Молекула каталитической ДНК по п.33, отличающаяся тем, что указанная вторая область связывания субстрата включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей:TATGTGACGCTA (SEQ ID N° 42),
TATAGTCGTA (SEQ ID N° 43),
ATAGCGTATTA (SEQ ID N° 44),
ATAGTTACGTCAT (SEQ ID N° 45),
AATAGTGAAGTGTT (SEQ ID N° 46),
TATAGTGTA,
ATAGTCGGT,
ATAGGCCCGGT (SEQ ID N° 47),
AATAGTGAGGCTTG (SEQ ID N° 48) и
ATGNTG.
37. Молекула каталитической ДНК по п.33, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит третью область связывания субстрата, при этом указанная третья область связывания субстрата включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей TGTT, TGTTA и TGTTAG.38. Молекула каталитической ДНК по п.34, отличающаяся тем, что указанная одна или более консервативная область включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей CG, CGA, AGCG, AGCCG, CAGCGAT, CTTGTT и CTTATTT.39. Молекула каталитической ДНК по п.34, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит одну или более вариабельную область или нуклеотидный спенсер между указанными консервативными областями в указанном консервативном ядре.40. Молекула каталитической ДНК по п.37, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит одну или более спейсерную область между указанными областями связывания субстрата.41. Молекула каталитической ДНК по п.37, отличающаяся тем, что указанная эндонуклеазная активность является специфичной для нуклеотидной последовательности, определяющей сайт расщепления, содержащий однонитевую нуклеиновую кислоту в последовательности субстратной нуклеиновой кислоты.42. Молекула каталитической ДНК по п.37, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК является однонитевой.43. Молекула каталитической ДНК по п.37, отличающаяся тем, что указанная однонитевая нуклеиновая кислота содержит РНК, ДНК, модифицированную РНК, модифицированную ДНК, аналог нуклеотида или их смесь.44. Молекула каталитической ДНК по п.41, отличающаяся тем, что указанная субстратная нуклеиновая кислота содержит РНК, ДНК, модифицированную РНК, модифицированную ДНК, аналог нуклеотида или их смесь.45. Молекула каталитической ДНК по п.41, отличающаяся тем, что указанная эндонуклеазная активность включает гидролитическое расщепление фосфоэфирной связи в указанном сайте расщепления.46. Композиция, расщепляющая нуклеиновую кислоту, содержащая две или более совокупности молекул каталитической ДНК по п.7, где каждая группа молекул каталитической ДНК расщепляет субстратную нуклеиновую кислоту по различным сайтам расщепления.47. Композиция по п.46, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит катион.48. Композиция по п.47, отличающаяся тем, что указанный катион выбирают из группы, состоящей из Рb+2, Mg+2, Mn+2, Zn+2, Са+2, Na+ и К+.49. Композиция по п.48, отличающаяся тем, что указанный катион выбирают из группы, состоящей из Рb+2, Mg+2, Zn+2, Са+2, Na+ и К+.50. Способ расщепления фосфоэфирной связи в субстрате, включающий следующие стадии: а) смешивание молекулы каталитической ДНК по п.7 с субстратом, содержащим фосфоэфирную связь, до получения реакционной смеси; б) выдерживание указанной смеси в заранее определенных условиях реакции, позволяющих обеспечить расщепление указанной фосфоэфирной связи молекулой каталитической ДНК и получение совокупности продуктов расщепления субстрата; в) разделение указанных продуктов и молекул каталитической ДНК и г) добавление дополнительного субстрата, приемлемого для указанных молекул каталитической ДНК, до образования новой реакционной смеси.51. Способ по п.50, отличающийся тем, что заранее определенные условия реакции включают добавление одновалентного или двухвалентного катиона.52. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанный катион выбирают из группы, состоящей из Рb+2, Mg+2, Mn+2, Zn+2, Са+2, Na+ и К+.53. Способ по п.50, отличающийся тем, что заранее определенные условия реакции включают присутствие одновалентного катиона, двухвалентного катиона или и того и другого вместе.54. Способ по п.50, отличающийся тем, что субстрат содержит PHK.55. Способ селекции молекулы каталитической ДНК, расщепляющей субстратную нуклеиновую кислоту по специфическому сайту, включающий стадии: а) получение совокупности однонитевых молекул ДНК; б) смешивание нуклеотидсодержащих субстратных молекул с указанной совокупностью молекул однонитевой ДНК до образования смеси; в) выдерживание указанной смеси в течение периода времени и при заранее определенных условиях реакции, достаточных для расщепления указанной субстратной последовательности с помощью совокупности однонитевых молекул ДНК с образованием продуктов расщепления субстрата; г) разделение совокупности однонитевых молекул ДНК, субстратных последовательностей и продуктов расщепления субстрата; в) отделение молекул однонитевой ДНК, расщепляющей нуклеотидсодержащий субстрат по специфическим сайтам из указанной совокупности.56. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанный субстрат содержит PHK.57. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанная молекула ДНК помечена иммобилизирующим агентом.58. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанный агент содержит биотин.59. Способ по п.58, отличающийся тем, что стадия отделения дополнительно включает экспонирование указанной меченой молекулы ДНК с твердой поверхностью, имеющей пришитый к ней авидин, в результате чего указанные меченые молекулы ДНК прикрепляются к указанной твердой поверхности.60. Способ селекции in vitro молекул каталитической ДНК, расщепляющей фосфоэфирные связи в субстратной нуклеиновой кислоте, включающий следующие стадии: а) получение совокупности молекул однонитевой ДНК по п.7; б) введение генетического изменения в указанную совокупность с получением совокупности варианта; в) селекция индивидуальных вариантов в указанной совокупности варианта, который соответствует предварительно определенным критериям селекции; г) селекция индивидуального варианта из остатка указанной совокупности варианта; д) амплификация указанного селекционного индивидуального варианта и получение in vitro молекулы селекционной каталитической ДНК, которая расщепляет фосфоэфирную связь в субстратной нуклеиновой кислоте.61. Молекула энзиматической ДНК, содержащая дезоксирибонуклеотидный полимер, обладающая каталитической активностью для расщепления субстрата, содержащего нуклеиновую кислоту, с получением продукта расщепления указанной молекулой энзиматической кислоты, причем указанная энзиматическая молекула ДНК получена способом, включающим стадии: а) смешивание популяции однонитевой молекулы ДНК с молекулами субстратной нуклеиновой кислоты, содержащей рибонуклеотиды до образования смеси; б) выдерживание указанной смеси достаточный период времени и при заранее определенных условиях реакции, чтобы позволить молекулам однонитевой ДНК в совокупности нуклеиновых кислот вызвать расщепление молекул указанной субстратной нуклеиновой кислоты с получением продуктов расщепления субстрата; и в) выделение молекул однонитевой ДНК, которые расщепляют указанные молекулы субстратной нуклеиновой кислоты, из указанной совокупности нуклеиновых кислот.62. Молекула энзиматической ДНК по п.61, где указанная молекула энзиматической ДНК обладает средством связывания к указанному субстрату и лишена сродства связывания к указанному продукту расщепления.63. Молекула энзиматической ДНК, содержащая консервативный домен, фланкированный двумя доменами связывания субстрата, причем указанная молекула энзиматической ДНК получена способом, включающим стадии: а) смешивание совокупности молекул однонитевой ДНК с молекулами субстратной нуклеиновой кислоты, содержащей рибонуклеотиды до образования смеси, б) выдерживание указанной смеси достаточный промежуток времени и при заранее определенный условиях реакции, чтобы позволить молекулам однонитевой ДНК в данной совокупности вызвать расщепление указанных молекул субстратной нуклеиновой кислоты до получения продуктов расщепления субстрата, и в) выделение молекул однонитевой ДНК, которая расщепляет указанные молекулы субстратной нуклеиновой кислоты, из указанной совокупности.64. Не встречающаяся в природе молекула каталитической ДНК, содержащая последовательность нуклеотидов, определяющую консервативное, фланкированное одним или более доменами распознавания, вариабельными областями и спейсерными областями.65. Молекула ДНК по п.64, где указанная нуклеотидная последовательность определяет первую вариабельную область, соседнюю или прилегающую к 5’-концу молекулы, первый домен распознавания, расположенный по 3’-концу к первой вариабельной области, первую спейсерную область, расположенную по 3’-концу к первому домену распознавания, первую консервативную область, расположенную по 3’-концу к первой спейсерной области, вторую спейсерную область, расположенную по 3'-концу к первой консервативной области, вторую консервативную область, расположенную по 3’-концу ко второй спейсерной области, второй домен распознавания, расположенный по 3’-концу ко второй консервативной области, и вторую вариабельную область, расположенную по 3’-концу ко второму домену распознавания.66. Молекула ДНК по 64, отличающаяся тем, что указанная нуклеотидная последовательность определяет первую вариабельную область, соседнюю или прилегающую к 5’-концу молекулы, первый домен распознавания, расположенный по 3’-концу к первой вариабельной области, первую спейсерную область, расположенную по 3’-концу к первому домену распознавания, первую консервативную область, расположенную по 3’-концу к первой спейсерной области, вторую спейсерную область, расположенную по 3’-концу к первой консервативной области, вторую консервативную область, расположенную по 3’-концу ко второй спейсерной области, второй домен распознавания, расположенный по 3’-концу ко второй консервативной области, вторую вариабельную область, расположенную по 3’-концу ко второму домену распознавания, и третий домен распознавания, расположенный по 3’-концу ко второй вариабельной области.
