СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ХАНТАВИРУСОВ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/531 A61K39/12 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано для серологической диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и лабораторных исследований при изучении биологических и антигенных свойств штаммов хантавирусов, а также может найти применение в производстве диагностических тест-систем для нужд практического здравоохранения.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) из-за вариабельности клинического течения и отсутствия в первые дни болезни характерных для данного заболевания признаков, а также существования легких и абортивных форм, относится к числу трудно диагностируемых заболеваний, особенно на ранних стадиях болезни. Поэтому вопросы специфической диагностики ГЛПС имеют большое значение, и поиск путей ее совершенствования сохраняет свою актуальность, несмотря на многочисленные разносторонние исследования данной инфекции.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА), чувствительность которой при выявлении антител в значительной мере зависит от специфической активности используемых антигенов, широко используется для проведения диагностических, серологических и эпидемиологических исследований с арбовирусами. Однако при хантавирусных инфекциях эта реакция применяется реже ввиду трудности получения стабильных высокоактивных гемагглютинирующих антигенов хантавирусов.

Известен способ получения гемагглютинирующего антигена хантавирусов из мозга зараженных хантавирусом мышей-сосунков сахарозоацетоновой экстракцией (Tsai T.F., Tang Y.W., Ни S.L. et al. Haemagglutination-inhibition antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome. // J.Infect.Dis. - 1984. - Vol. 150. - P. 895-898). Низкая гемагглютинирующая активность антигенов, приготовленных по данному способу, снижает их специфичность и чувствительность.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения гемагглютинирующих антигенов Хантавирусов из вируссодержащей тканевой культуральной жидкости, включающий инфицирование культуры клеток штаммом хантавирусов, культивирование его, выделение целевого продукта путем концентрирования вируссодержащей культуральной жидкости с помощью ультрацентрифугирования при 25000 об/мин в течение двух часов и последующей обработки ацетоном и ультразвуковым гомогенизированием (Okuno Y., Yamanishi К., Takahashi Y. et al. Haemagglutination-inhibition test for hemorrhagic fever with renal syndrome using virus antigen prepared from infected tissue culture fluid.- J. Gen.Virol. -1986.-Vol.67.-P. 146-156).

Этот способ позволяет получать антигены, обладающие высокой гемагглютинирующей активностью. Однако он имеет ряд недостатков: невысокую стабильность и чувствительность антигенных препаратов, небольшой объем выхода целевого продукта, трудоемкость технологического процесса из-за использования сложного дорогостоящего оборудования. В силу этих причин способ используется только в лабораторной практике.

Задачей данного изобретения является повышение чувствительности, специфичности и стабильности диагностикума, увеличение объема выхода целевого продукта и упрощение технологического процесса.

Это достигается тем, что инфицирование культуры клеток проводят штаммами Хантавирусов разных серотипов, а именно штаммом вируса Хантаан АА-10508, АР-4590, CRT-4959 или CRT-4450, выделенных от полевой и восточно-азиатской мышей, красной и красно-серой полевок соответственно, или штаммом вируса Сеул SR-11, Р-9303, выделенных от серой крысы и больного ГЛПС соответственно, или штаммом вируса Пуумала CG-1820, MF-5302, АР- 4588, выделенных от рыжей и дальневосточной полевок и восточно-азиатской мыши соответственно, а целевой продукт получают путем концентрирования вируссодержащей культуральной жидкости с помощью низкоскоростного центрифугирования в присутствии 7,5-8,5% полиэтиленгликоля и последующей обработки твин-80 и эфиром.

Использование штаммов хантавирусов, выделенных из разных источников (от больных ГЛПС и грызунов - природных носителей хантавирусов), позволяет повысить специфическую активность и чувствительность диагностикума хантавирусов при выявлении специфических антител в исследуемых сыворотках крови и тем самым способствует решению актуальной проблемы серологической разведки и ранней диагностики хантавирусной инфекции.

Использование полиэтиленгликоля для концентрирования исходного вируссодержащего материала позволяет осадить вирионы менее трудоемким способом с помощью низкоскоростного центрифугирования и тем самым упрощает технологию получения целевого продукта.

Твин-эфирная дезинтеграция (вместо трудоемкой ацетон-ультразвуковой) повышает титр гемагглютинирующей активности за счет освобождения от ингибиторов скрытых гемагглютининов, не оказывая какого-либо существенного влияния на специфическую активность и чувствительность антигенных детерминант, ответственных за гемагглютинирующую активность; стабилизирует вирионы, предотвращая их агрегацию, что способствует повышению конечного выхода целевого продукта, его антигенной активности и стабильности. При совместном воздействии твин-80 и эфира происходит инактивация инфекционного вируса - это позволяет применять целевой продукт, как в научно-исследовательских лабораториях, так и в органах практического здравоохранения.

Примеры конкретного выполнения:
Пример 1. Для получения антигенных препаратов вируса Хантаан клетки Vero E-6 выращивают на 1,5 л культуральном матрасе до образования полного монослоя, инфицируют штаммом АА-10508, АР-4590, CRT-4959 или CRF-4450. Вирус культивируют в 250 мл среды Игла 2-МЕМ и среды 199 (в равных соотношениях) с 3,5% нормальной телячьей сыворотки с антибиотиками в течение 8-10 суток. После окончания инкубации вируссодержащую культуральную жидкость сливают и при наличии в 80-100% инфицированных клеток специфического свечения в непрямом методе флюоресцирующих антител (НМФА) используют в качестве исходного материала для получения антигенного препарата.

Концентрацию хантавируса проводят с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ, м.м. 6000, фирма "Serva"), который добавляют постепенно в вируссодержащую культуральную жидкость до конечной концентрации 8,5%. Смесь интенсивно встряхивают до полного растворения ПЭГ и оставляют на 18-20 часов при температуре 4^oС. Осадок (преципитирующий антиген) уплотняют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 минут на центрифуге К-24. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 10 мл (в объеме в 25 раз меньше исходного вируссодержащего материала) боратного буферного раствора рН 9,0 с 0,4% бычьего альбумина. Восстановленный осадок обрабатывают детергентом твин-80 (фирма "Serva") в количестве, составляющем 0,125% от объема (вносят 0,125 мл 10% раствора твин-80) при интенсивном встряхивании в течение 5 минут. Затем добавляют эфир в половинном объеме восстановленного осадка и интенсивно встряхивают в течение 40 мин. Выделяют нижний, содержащий целевой продукт, слой после центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 минут и выдерживают в открытом виде до полного испарения эфира.

Объем выхода целевого продукта с 250 мл исходной культуральной жидкости составляет 10 мл. Полученный антигенный препарат хранят при -25^oС в жидком или лиофилизированном состоянии. Титры гемагглютинирующей активности антигенных препаратов штаммов АА-10508, АР-4590, CRT-4959 и CRF-4450 в реакции гемагглютинации (РГА) составляют 1:2048, 1:512, 1:256 и 1:128, соответственно; стабильны в течение 18 месяцев и более.

Одновременно для контроля специфичности целевого продукта аналогично обрабатывают культуральную жидкость, собранную с неинфицированной хантавирусом культуры клеток Vero E-6.

Пример 2. Получение антигенного препарата вируса Сеул аналогично примеру 1. Клетки Vero E-6 инфицируют штаммом SR-11 или Р-9303. Культивирование вируса Сеул проводят в течение 10-12 суток. Концентрирование вируссодержащего материала проводят в присутствии 8% ПЭГ. Объем выхода целевого продукта с 250 мл исходной культуральной жидкости составляет 10 мл. Титры гемагглютинирующей активности антигенных препаратов штаммов SR-11 и Р-9303 в РГА составляют 1:512 и 1:128, соответственно; стабильны в течение 15 месяцев и более.

Пример 3. Получение антигенного препарата вируса Пуумала аналогично примеру 1. Клетки Vero E-6 инфицируют штаммом CG-1820, MF-5302 или АР-4588. Культивирование вируса Пуумала проводят в течение 12-14 суток. Концентрирование вируссодержащего материала проводят в присутствии 7,5% ПЭГ. Объем выхода целевого продукта с 250 мл исходной культуральной жидкости составляет 10 мл. Титры гемагглютинирующей активности антигенных препаратов штаммов CG-1820, MF-5302 и АР-4588 в РГА составляют 1:256, 1:128 и 1:128, соответственно; стабильны в течение 12 месяцев и более.

Специфичность и чувствительность антигенных препаратов, приготовленных по предлагаемому способу, оценена при параллельном титровании в двух серологических реакциях - РТГА и НМФА - сывороток крови от больных ГЛПС и реконвалесцентов, от иммунных и диких животных. Параллельно все исследуемые сыворотки крови проверяли в реакции с контрольным антигеном, приготовленным из незараженной культуральной жидкости. Обработка исследуемого материала показала, что результаты, полученные в РТГА, совпадают с результатами, полученными в НМФА, и что препараты, полученные по предлагаемому способу, могут быть успешно использованы для серодиагностики ГЛПС.

Преимущества заявляемого способа по сравнению с прототипом и признаки, обеспечивающие эти преимущества, представлены в табл.1. Из данных табл. 1 видно, что объем выхода целевого продукта, полученного по предлагаемому способу, в два раза превышает объем выхода целевого продукта, полученного по прототипу; антигенные препараты, полученные по предлагаемому способу, обладают хорошей стабильностью по сохранению титров гемагглютинирующей активности и высокой чувствительностью по выявлению специфических антител. Кроме того, предлагаемый способ имеет ряд преимуществ перед прототипом: упрощен этап концентрации, дезинтеграции и инактивации вирионов; сокращено время получения целевого продукта; исключено использование дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуги и ультразвукового гомогенизатора) и больших объемов ацетона.

Широкий диапазон клинических проявлений хантавирусной инфекции, сходство по симптоматике, особенно в начальном периоде заболевания, с другими инфекционными болезнями затрудняют своевременную и качественную диагностику ГЛПС. При исследовании в РТГА сывороток крови от больных с различными диагнозами инфекционных заболеваний, собранных в очагах ГЛПС Приморского края, установлена высокая эффективность предлагаемого диагностикума по выявлению специфических антител (антигемагглютининов) к серотипам хантавирусов на ранней стадии болезни (табл.2). Полученные данные показали, что диагностикум может быть использован не только для ранней диагностики ГЛПС, но и для дифференциальной диагностики хантавирусных лихорадок (установление этиологического агента - серотипа хантавирусов, вызвавшего заболевание).

Антигенные препараты, полученные по предлагаемому способу, агглютинируют гусиные эритроциты при оптимальном значении рН 5,75; характеризуются четкой гемагглютинирующей активностью с титрами в РГА 1:2048-1:128 (в отличие от исходных вируссодержащих культуральных жидкостей, имеющих титр в РГА 1:8-1: 2); обладают хорошей стабильностью, сохраняясь без существенного изменения в титре более 12 месяцев; проявляют высокую чувствительность и специфичность и могут быть успешно использованы в РТГА для обнаружения антигемагглютининов в сыворотках крови больных ГЛПС, иммунных и перенесших инфекцию животных.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить конечный выход целевого продукта, упростить технологический процесс и тем самым снизить себестоимость диагностикума. Использование в серологических исследованиях антигенных препаратов вирусов Хантаан, Сеул и Пуумала способствует ранней и дифференциальной диагностике хантавирусной инфекции и, следовательно, своевременной госпитализации и выбору правильной тактики ведения и лечения больных ГЛПС.

Высокая эффективность и экономичность предлагаемого способа, позволяющего получать стабильные, высокочувствительные и специфичные антигенные препараты, дает основание рекомендовать его для производственного получения диагностикума хантавирусов.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Получение диагностикума Хантавирусов осуществляется путем инфицирования культуры клеток штаммом хантавирусов, культивирования штамма и сбора вируссодержащей культуральной жидкости с последующим выделением целевого продукта. Диагностикум может быть использован для серологической диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и лабораторных исследований при изучении биологических и антигенных свойств штаммов хантавирусов. Диагностикум также можно применить в производстве диагностических тест-систем для нужд практического здравоохранения. 2 табл.

Способ получения диагностикума Хантавирусов, включающий инфицирование культуры клеток штаммом хантавирусов, культивирование штамма и сбор вируссодержащей культуральной жидкости с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве штамма хантавирусов используют штамм вируса Хантаан АА-10508, АР-4590, CRT-4959, CRF-4450 или штамм вируса Сеул SR-11, Р-9303 или штамм вируса Пуумала CG-1820, МF-5302, АР-4588, а выделение целевого продукта проводят путем концентрирования вируссодержащего материала низкоскоростным центрифугированием в присутствии 7,5-8,5% полиэтиленгликоля, обработкой твин-80 и эфиром.