СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/60 A61K35/12 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ.

В настоящее время накоплено множество фактов, на основании которых можно сформулировать гипотезу о том, что брюшина, брюшная полость и перитонеальный транссудат являются важными звеньями регуляции базального уровня гомеостаза, основные функции которого связаны с обеспечением дезинтоксикационных, адаптационных и противоопухолевых механизмов. При этом гуморальные реакции, возникающие в брюшине и брюшной полости, не ограничиваются локальным уровнем, они формируют эффекторные звенья регуляции гомеостаза в масштабах всего организма.

В соответствии с данными сравнительной зоологии и анатомии у многоклеточных организмов на ранних этапах эволюции формируется межорганная полость тела - целомическая.

Первичная целомическая полость - это полость между клеточными массами зародыша и трофобласта. Выделяют эмбриональный целом, который дифференцируется, и внезародышевый или экзоцелом. Экзоцелом постепенно отграничивается от эмбрионального целома и отделяется от последнего и зародыша наружной серозной оболочкой. Зародышевый целом занимает положение между кишечной трубкой и стенками тела зародыша. Клетки, выстилающие стенки целомических полостей, контактируют между собой через первичную целомическую жидкость, в которой определяется высокая концентрация факторов детерминации роста.

В процессе смещения эмбриональных листков, выстилающих целом, в него мигрируют половые клетки из внезародышевого желточного мешка. В последующем в целоме происходит их дифференцировка. Таким образом, целом можно рассматривать как центр, обеспечивающий сохранение, развитие и реализацию наследственной информации. Клеточный аффинитет (сродство) не видоспецифичен, он выступает в роли фактора, упорядочивающего ход органогенеза. Механизмы, лежащие в основе морфогенетических перемещений, недостаточно изучены, однако на основе имеющихся фактов можно предположить, что именно целомическая полость на ранних стадиях эмбрионального развития обеспечивает стабильное протекание процессов, имеющих жизненно важное значение как для индивида, так и с точки зрения видовой стабильности.

Целомическая полость является полифункциональным образованием. В частности, у первичноротых и вторичноротых установлено значение целома в формировании гидроскелета. Движение червей обеспечивается переменным сокращением кольцевых и продольных мышц. Многие органы высших животных представляют полые мышечные образования, которым целом создает топографическую подвижность при изменении внутреннего объема и работе мышечной системы (кишечник, сердце, маточные трубы и др.).

У многих современных типов многоклеточных целом в филогенезе, по-видимому, возникает из боковых выпячиваний гастральной полости (теория гастреи). У кишечнополостных (полипов) имеются гастральные карманы с сегментированной гастральной полостью - предшественниками целома. Важен полиморфизм полипов - различают питающие, защитные и половые особи, но поскольку гастральные полости всех полипов сообщаются между собой энтодермальными каналами, то обеспечиваются пищей и защитой все члены колонии.

У низших червей целом отсутствует. Целом впервые появляется у групп с активным поступательным движением - у билатерально-симметричных или целомических животных. Присутствие целома у всех типов высших многоклеточных животных свидетельствует о его значительной функциональной роли. Все билатеральные животные обладают мезодермой, которая и участвует в формировании целомической полости. У кольчатых, червей или аннелид сегментируется тело и каждый сегмент имеет левый и правый целомический мешок, ганглии, нефридии и гонады. У членистоногих целомические мешки в эмбриогенезе закладываются метамерно, но не сохраняются. Просвет целома объединяется с первичной полостью тела, образуя миксоцель. Остатки целома сохраняются вокруг нефридиев и гонад. Сердечная трубка сообщается с миксоцелем, и членистоногие обладают незамкнутой кровеносной системой. Миксоцель заполняется кровью и лимфой - гемолимфой.

У позвоночных целом развивается независимо от кишечной полости. Целомическая полость сообщается с внешней средой через воронки выделительных каналов у низших позвоночных, а у высших позвоночных - через яйцеводы. Развитие целома у позвоночных не имеет следов сегментации. Боковые пластинки мезодермы монолитны и расслаиваются на наружную (париетальную) и внутреннюю (висцеральную) стенки с образованием наполненной жидкостью целомической полостью между ними при формировании туловища зародыша.

У рыб перикардиальная полость отделяется от главной. У амфибий и рептилий появляются легкие, но полости, в которых они располагаются, сообщаются с главным целомом.

Целом у млекопитающих дифференцирован в правую и левую плевральные полости, перикардиальную полость и перитонеальную полость с развитыми углублениями - карманами (влагалищные карманы для яичек, сальниковая сумка у кишечника).

Серозная оболочка (брюшина), выстилающая перитонеальную полость, неоднородна с функциональной точки зрения. Некоторые участки брюшины являются секретирующими (брюшина тонкой кишки, широкой связки матки), некоторые - всасывающими (брюшина диафрагмы и слепой кишки). Поверхность брюшины у взрослого человека составляет около 2,5 м². Перитонеальная жидкость содержит 2-2,5 г/л клеток, главным образом макрофагов, и небольшое количество сегментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов. Эпителиальное покрытие представлено мезотелием, под которым располагается сложная соединительнотканная основа, в которой находятся кровеносные и лимфатические сосуды и нервные волокна с периневральными влагалищами.

Для транссудирующих участков характерно более поверхностное расположение кровеносной сети по сравнению с лимфатической. Во всасывающих участках (особенно в области диафрагмы) ближе к поверхности располагается лимфатическая сеть, кровеносная под ней. Важную роль при резорбции выполняет лимфатическая сеть сосудов в сальнике, поверхность которого составляет около 1 м². На индифферентных участках брюшины соотношение между транссудацией и резорбцией уравновешено из-за одинакового расположения кровеносных и лимфатических сетей.

Всасывание воды, истинных и коллоидных растворов и взвесей из брюшной полости подчинено общим закономерностям всасывания в лимфатическую и кровеносную систему из тканей тела. Резорбция коллоидов и суспензий идет по путям лимфатической системы. Брюшина способна всасывать крупные частицы и даже эритроциты. Сравнительное прижизненное изучение резорбции перитонеальной жидкости в лимфатические капилляры у амфибий и млекопитающих демонстрирует общий механизм движения жидкости вследствие отрицательного гидростатического давления и дополнительного вазомоторного перемещения из-за сокращения лимфангионов (6-12 сокращений в минуту) в лимфатических сосудах.

Целомическая и брюшная полость оказывают системное влияние через гуморальные эффекторные механизмы. Существует класс биологически активных веществ с низко- и среднемолекулярной массой, которые не обладают видовой специфичностью (Balazs A., Blazek S. Эндогенные ингибиторы клеточной пролиферации: Пер. с англ. /M.: Мир, 1982. - 302 с.). Однако наибольший биологический эффект при их использовании установлен в тех случаях, когда дозы этих соединений малы и их сложно контролировать даже при помощи наиболее чувствительных современных методов, таких как изотопные, иммунологические и т.п. (И. П. Ашмарин, Е.П.Казареева, Т.В.Лелекова. Проблемы эффективности ультрамалых доз и концентраций эндогенных и экзогенных веществ. /Материалы 5-й Международной конференции "Нейроиммунология, эпидемиология и интерферонология рассеянного склероза" 26-29 мая 1996 года, Санкт-Петербург, 1996. - С. 29-34; Факторы малой интенсивности в биоактивации и иммунокоррекции: Монография. / А.А.Подколзин, В.И.Донцов. - Москва, 1995. - 195 с.).

В соответствии с предложенной гипотезой о влиянии целомической и брюшной полостей на течение важнейших гомеостатических процессов целью изобретения является разработка способа получения биологически активных веществ различной специфичности.

Известен способ (прототип) получения различных популяций клеток (в основном - макрофагов и полиморфноядерных гранулоцитов) путем промывания брюшной полости животного физиологическим раствором (Лимфоциты. Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Клауса. - М.: Мир, 1990. - с 36-39).

Задачей настоящего изобретения является получение биологически активных веществ, обладающих дезинтоксикационными свойствами, влияющими на пролиферацию (размножение) биологических объектов, а также для профилактики гипоксии, гипотермии и т.д.

Поставленная задача решается следующим образом:
Для повышения специфичности и усиления влияния биологически активных веществ в целомическую полость рыб и пресмыкающихся и в брюшную полость млекопитающих вводился физиологический раствор, а в целомическую полость пресмыкающихся и в брюшную полость млекопитающих вводились олеаты. После экспозиции растворов в течение нескольких часов, они извлекались из внутренней полости живых организмов. Через сутки после хранения при температуре 4^oС, получали супернатант, который подвергался разведению и потенцированию в 18^o водно-спиртовом растворе до концентрации 10⁶(С3)-10¹⁰(С5).

В целомическую полость рыб и пресмыкающихся вводили 0,9% раствор NaCl комнатной температуры. В брюшную полость млекопитающих вводили 0,9% раствор NaCl, нагретый до 40^oС.

В целомическую полость пресмыкающихся и в брюшную полость млекопитающих вводили олеаты, нагретые до 40^oС.

В состав олеатов входят липиды, содержащиеся в персиковом масле. Олеат представляет собой сложный эфир глицерина и высших (прямоцепочечных) жирных карболовых кислот. Олеат содержит в основном остатки ненасыщенных кислот: олеиновую (С₁₇Н₃₃СООН), линолевую (C₁₇H₃₁COOH), линоленовую (C₁₇H₂₉COOH) (Слесарев В.И. Основы химии живого. - СПб. - 2000. - с.514).

Олеаты, вводимые во внутренние полости живых организмов, подвергали эмульгированию путем добавления к 1 мл олеата 6% раствора этанола (С₂Н₅ОН) на 10 мл физиологического раствора.

Объем вводимых растворов и олеатов не превышал 50% объема целомической или брюшной полости.

В качестве объектов для получения биологически активных веществ использовали карасей, черепах, лабораторных крыс и мышей.

Объектом исследования биологической активности полученных препаратов являлась культура речных рачков Daphnia magna Straus из Лаборатории биотестирования и токсикологического контроля природных и сточных вод системы Минприроды РФ г. Кирова.

Установлено, что препарат из целомической полости рыб повышает устойчивость биологических объектов к низким температурам (гипотермии).

Препарат, полученный из целомической полости пресмыкающихся, повышает устойчивость биологических объектов к пониженному содержанию кислорода в окружающей среде (гипоксии).

Препараты, полученные из целомической полости рыб и пресмыкающихся и брюшной полости млекопитающих, обладают дезинтоксикационными свойствами, а также влияют на пролиферацию (размножение) биологических объектов.

Изучение дезинтоксикационных свойств препаратов проводилось при исследовании чувствительности дафний к этанолу. Проведена оценка эффективности препаратов С3 и С6, полученных при введении физиологического раствора.

Поставлено 7 опытов с разными поколениями дафний. В контрольной группе выживаемость составляла 50%. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1 и 2.

Таким образом, препараты, полученные из целомической и брюшной полостей, обладают дезинтоксикационной активностью, что обеспечивает большую выживаемость дафний в растворе этанола по сравнению с контролем, при этом наиболее эффективными являются препараты из брюшной полости млекопитающих. Существенной разницы между С₃ и С₅ разведениями не установлено.

С целью изучения влияния препаратов, полученных после введения в целомическую и брюшную полости физиологического раствора и олеата, на процессы пролиферации, была использована культура беременных самок Daphnia magna Straus.

Проводилась оценка плодовитости дафний при добавлении в раствор 3 капель препарата на физиологическом растворе в концентрации 10⁶(С₃) и 10¹²(С₆) и 3 капель олеата в концентрации 10⁶(С₃) и 10¹²(С₆). Контрольную группу составили дафнии, содержащиеся в обычных условиях. Поставлено 5 опытов с различными поколениями дафний.

Установлено, что препарат из брюшной полости на основе физиологического раствора уменьшает плодовитость дафний почти в 2 раза.

Олеат из целомической полости пресмыкающихся увеличивает плодовитость дафний в 1,3 раза, олеат из брюшной полости млекопитающих увеличивает плодовитость дафний в 1,1 раза.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что у целомических организмов внутренняя полость обеспечивает стабильное протекание основных гомеостатических реакций, в то время как лимфатическая система у них находится в стадии становления. В процессе эволюции дифференцировка, дробление целомической полости и образование нескольких внутренних полостей у высокоорганизованных живых организмов совпадает с завершением формирования совершенной лимфатической системы и образованием клеточного и гуморального иммунитета, который в силу своей эволюционной молодости является достаточно уязвимым для дестабилизирующих воздействий внешней и внутренней среды. При этом брюшная полость остается филогенетически древним, базисным центром регуляции важнейших функций гомеостаза, таких как контроль за дезинтоксикационными реакциями, контроль за пролиферацией тканей и обеспечение процессов адаптации.

Итак, целомическая и брюшная полости принимают участие в формировании эффекторных механизмов, обеспечивая тем самым стабилизацию основных жизненно важных гуморально-клеточных реакций организма.

Использование целомической и брюшной полостей с целью получения биологически активных веществ на основе физиологического раствора и олеата, является основой для создания препаратов с различными свойствами.

Препараты из целомической полости рыб и пресмыкающихся обладают характеристиками адаптогенов и могут применяться для профилактики и лечения переохлаждения (гипотермии), для профилактики и лечения состояний, связанных с низким содержанием кислорода (гипоксией).

Препараты из брюшной полости млекопитающих перспективны в терапии интоксикационных синдромов и отравлений различного генеза.

Препараты из целомической и брюшной полостей на основе физиологического раствора снижают пролиферативную способность живых организмов, что является поводом для дальнейшего исследования их роли в онкологии.

Препараты из целомической и брюшной полостей на основе олеата умеренно стимулируют пролиферативную активность, что представляется важным при необходимости восстановления кроветворения после лечебных цитодеструктивных воздействий, а также с целью профилактики угнетения гемопоэза под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ. Использование целомической и брюшной полостей живых организмов с целью получения биологически активных веществ с применением физиологического раствора и олеатов является основой для создания препаратов с различными свойствами. Изобретение обеспечивает профилактику гипоксии, гипотермии. 6 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения биологически активных веществ, характеризующийся тем, что солевой или масляный раствор вещества вводят в целомическую полость рыб, пресмыкающихся или брюшную полость млекопитающих, выдерживают не менее 6 ч, затем раствор извлекают из внутренней полости живого организма, выдерживают при низкой температуре, полученный супернатант разводят и потенцируют в 18% водно-спиртовом растворе до концентрации 10⁶(С₃)-10¹⁰(С₅).2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в целомическую полость рыб и пресмыкающихся вводят физиологический раствор комнатной температуры.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в брюшную полость млекопитающих вводят физиологический раствор, нагретый до 40°С.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в целомическую полость пресмыкающихся и в брюшную полость млекопитающих вводят олеаты, нагретые до 40°С.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в целомическую или брюшную полость вводят раствор в объеме, не превышающем 50% объема полости.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что солевой или масляный раствор вводят в целомическую полость карасей, черепах, брюшную полость лабораторных крыс, мышей.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор после извлечения из полости выдерживают при температуре 4°С.