ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII В СРЕДЕ, НЕ СОДЕРЖАЩЕЙ БЕЛКА Российский патент 2004 года по МПК C07K14/755 C12N5/00 

Изобретение относится к получению рекомбинантного фактора VIII, а именно к получению рекомбинантного фактора VIII в сыворотке или в среде, не содержащей белка.

Гемофилия А является связанным с Х-хромосомой рецессивным наследственным заболеванием, вызванным нарушением или недостаточностью фактора VIII, что приводит к повышенной кровоточивости. Для того чтобы контролировать случаи кровотечения, в лечении больных гемофилией используют фактор VIII. Исторически фактор VIII был выделен из плазмы крови человека. Однако терапия полученным из плазмы фактором VIII была связана с передачей некоторых человеческих вирусов, таких как вирус гепатита и вирус иммунодефицита человека.

С появлением технологии рекомбинантной ДНК была установлена структура человеческого фактора VIII и его гена. Транскриптом гена из 26 экзонов является молекула мРНК протяженностью примерно 9000 оснований, кодирующая белок, состоящий из 2351 аминокислоты. Исследования структуры фактора VIII свидетельствуют о том, что он представляет собой гликопротеин, содержащий значительное количество углеводных остатков.

Кодирующая фактор VIII кДНК была клонирована и стабильно экспрессирована в клетках почки новорожденного хомяка (ВНК-21) и в клетках яичника китайского хомяка (СНО). Для лечения гемофилии А были разработаны промышленные способы получения рекомбинантного фактора VIII. В настоящее время рекомбинантный фактор VIII производится генно-инженерным способом с использованием клеток млекопитающих, тем самым устраняется необходимость использования плазмы и сводится к минимуму вероятность внесения вируса.

Амплификация генов была тем самым методом, который обеспечил эффективное воспроизведение клеточных линий для получения белков терапевтического назначения. Стратегия амплификации состоит в привязке транскрибированного участка, кодирующего целевой белок, к амплифицируемому маркеру, такому как дигидрофолатредуктаза. Затем для внесения векторной ДНК в реципиентные клетки используется техника трансфекции. Отбирают популяции клеток с повышенной резистентностью к выбранному препарату, такому как метотрексат. Получение устойчивого клона достигается путем клонирования предельных разведений.

При получении и очистке лабильных белков, таких как фактор VIII, в качестве стабилизатора добавляется человеческий альбумин. Несмотря на то что при пастеризации альбумин подвергается вирусной инактивации, было бы предпочтительным производить рекомбинантный фактор VIII при полном отсутствии белков крови человека и млекопитающих. Заявитель обнаружил, что это осуществимо при использовании новой культуральной среды. Подробности описаны ниже.

Способ непрерывного получения относительно больших количеств рекомбинантного фактора VIII из клеток млекопитающих в отсутствие любых человеческих или полученных от млекопитающих белков плазмы состоит в культивировании клеток млекопитающего в среде, не содержащей белка, с добавлением полиольного полимера, такого как плюроник F-68. Предпочтительная среда содержит сульфат меди, комплекс этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с сульфатом железа и соли микроэлементов, таких как марганец, молибден, кремний, литий и хром.

Последние достижения в экспрессионной технологии рекомбинантного белка позволили производить белок в больших количествах в клетках млекопитающих. Клетки-хозяева, пригодные для получения фактора VIII, включают такие клеточные линии, как клетки ВНК, клетки СНО и человеческие эмбриональные клетки почки (НЕК). Особо предпочтительными являются клетки почки новорожденного хомяка, а именно те, которые трансфицированы геном, способным направлять экспрессию фактора VIII, как описано у Wood и др. (1984) (включая производные, такие как клональные варианты и их потомство). Такая клеточная линия была заложена на хранение в Американскую коллекцию типов культур и обозначена вступительным номером АТСС CRL-8544.

Требуемая клеточная линия, несущая ген фактора VIII, обычно адаптируется к росту в виде суспензионных культур в не содержащей белка среде продуцирования с добавлением липопротеина. Базальная среда, выбранная для культивирования клеточной линии, не является существенной для настоящего изобретения и может быть одной из сред, известных специалистам, или комбинацией таких сред, применяемых для культивирования клеток млекопитающих. Такие среды, как модифицированная Дюльбекко среда Игла, среда Хэма F-12, минимальная эссенциальная среда Игла, среда RPMI-1640 и им подобные, являются коммерчески доступными. О добавлении факторов роста, таких как рекомбинантный инсулин, известно специалистам.

По причине лабильности фактора VIII продуктивность подвергшихся генно-инженерной обработке клеток-хозяев в отсутствие белка значительно снижена. При получении рекомбинантных белков обычно используют человеческий сывороточный альбумин в качестве бессывороточной культуральной добавки. Человеческий сывороточный альбумин выполняет многочисленные функции, включая: 1) функцию носителя жирных кислот, холестерина и липофильных витаминов, стероидных гормонов и факторов роста; 2) функцию защитного агента от разрушения клеток; 3) функцию буфера при изменениях значений рН; 4) функцию регулятора осмотического давления. Другая важная роль альбумина, возможно, состоит в том, чтобы, служа субстратом для протеаз, защитить лабильные белки, такие как фактор VIII, от протеолиза.

Примеси, присутствующие в препаратах альбумина, могут также содействовать стабилизирующему эффекту альбумина. В качестве заменителей человеческого сывороточного альбумина при получении рекомбинантного фактора VIII в бессывороточных условиях были идентифицированы такие факторы, как липопротеин (Chan, 1996).

Попытка заявителя создать среду для продуцирования, не содержащую выделенного из человеческой плазмы альбумина, привела к открытию объекта данного изобретения - базальной среды, не содержащей белка, предназначенной для получения рекомбинантного фактора VIII. Предпочтительная среда состоит из модифицированной Дюльбекко минимальной эссенциальной среды и среды Хэма F-12 (50: 50 по весу) с добавлением 10 мкг/мл рекомбинантного инсулина (нуцеллин фирмы Эли Лилли) и 50 мкМ комплекса сульфата железа с этилендиаминтетрауксусной кислотой. На этой базальной среде, не содержащей белка, подвергшиеся генно-инженерной обработке клетки ВНК росли хорошо, если не учитывать продуцирование фактора VIII.

Неожиданным оказался тот факт, что добавление полиола, такого как плюроник F-68, не повлияло на рост клеток ВНК, но повысило их специфическую продуктивность в отношении фактора VIII. Непредвиденным оказалось и то, что добавление сульфата меди приводит к дальнейшему усилению образования фактора VIII. Включение в среду микроэлементов, таких как марганец, молибден, кремний, литий и хром, еще более усиливало образование фактора VIII. Затем был разработан непрерывный процесс продуцирования фактора VIII в условиях, при которых отсутствовал полученный из человеческой плазмы белок. Дальнейшую информацию об использовании полиолов типа плюроника можно найти в работах Papoutsakis (1991) и Schmolka (1977).

Плюроник F-68, полигликоль (фирма БАСФ, Вайандот), обычно используется для предотвращения вспенивания при перемешивании культур, для защиты клеток от разрушения и от повреждения пузырьками в барботируемой культуре. Плюроник F-68 представляет собой неионный блочный сополимер со средней молекулярной массой 8400 и состоит из центрального блока полиоксипропилена (20% весовых) и блоков полиоксиэтилена по обоим концам. Многочисленные исследования роли плюроника F-68 свидетельствуют о том, что он действует как поверхностно-активное вещество и предотвращает повреждение клеток, избавляя их от пузырьков, образующихся в биореакторах при перемешивании или барботировании. Однако некоторые исследователи отметили благоприятное действие плюроника F-68 на рост культуры в условиях минимального повреждения (Mizrahi, 1975; Murhammer, Goochee, 1990). Соочистка липидов с плюроником F-68 подтверждает, что полимер может не только заменять альбумин в качестве поверхностно-активного вещества, но и действовать в качестве носителя липидов. Плюроник F-68 может также предотвратить повреждение мембраны клетками-убийцами еще до того, как произойдет репарация, путем предполагаемого непосредственного интеркалирования в мембрану. Совершенно не изучена роль плюроника F-68, действующего в качестве металл-ионного буфера.

Несмотря на сообщения о том, что плюроник F-68 при добавлении в среду может повысить объемную продуктивность, механизм его действия, по-видимому, состоит в поддержании жизнеспособности клеток (Schneider, 1989; Qi, 1996). По имеющимся у заявителя данным, впервые показано, что плюроник F-68 усиливает специфическую продукцию конкретного белка. Поскольку в заявляемой системе жизнеспособность клеток и скорости их роста при добавлении плюроника F-68 и без него являются сопоставимыми, то в данном случае механизм действия плюроника F-68 не состоит в поддержании жизнеспособности клеток. Однако каков бы ни был механизм его действия, эффект добавления плюроника F-68 проявляется быстро и является выраженным.

Предполагается, что ряд других полиолов может оказывать подобное действие. Такие полиолы включают неионные блочные сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, имеющие молекулярную массу от примерно 1000 до примерно 16000.

Помимо обычного оборудования для суспензионного культивирования, такого как встряхиваемые сосуды, вращающиеся сосуды и перекатываемые по роликовому настилу бутыли, способ настоящего изобретения применим для биореакторов непрерывного и периодического действия. После культивирования клеток-хозяев фактор VIII может быть выделен из отработанной среды с помощью стандартных приемов, таких как ультрафильтрация или центрифугирование. При необходимости регенерированный фактор VIII может быть очищен хроматографией, например, ионообменной, эксклюзионной, иммуно-аффинной или металл-хелатной и т.п.

Использованный здесь термин "среда, не содержащая белка человека или млекопитающего" означает культуральную среду, в которой нет белков, полученных от человека или млекопитающих. Белкам, выделенным из человеческих источников или от млекопитающих, сопутствует риск вирусного инфицирования. Цель создания среды, не содержащей белка человека или млекопитающих, состоит в том, чтобы исключить или, по меньшей мере, значительно снизить опасность передачи вируса.

Пример 1
Клетки почки новорожденного хомяка (ВНК-21), трансфицированные геном, способным вызвать экспрессию фактора VIII, были получены от фирмы Дженентек, Инк. Южный Сан-Франциско, Калифорния, США. Клеточная линия получена, как подробно описано Wood и др. (1984), и заложена на хранение в Американскую коллекцию типов культур под вступительным номером АТСС CRL-8544. Клональный вариант этих клеток получали также от фирмы Дженентек, Инк. и использовали во всех примерах.

Клетки ВНК-21, содержащие ген, кодирующий фактор VIII, культивировали в виде суспензионных культур во встряхиваемых сосудах, используя бессывороточную базальную среду, которая содержала среду Хэма F-12 и минимальную эссенциальную среду Дюльбекко (50:50 по весу), нуцеллин (рекомбинантный инсулин, 5-10 мкг/мл) комплекс ЭДТА с FeSО4 (50 мкМ) и MgCl₂ (15 мМ). Клетки поддерживали и пассировали с 48-часовыми интервалами. Клетки центрифугировали при 800g в течение 5 минут, считали и пересевали с плотностью 1•10⁶ клеток/мл. Каждый сосуд содержал 50-100 мл свежей среды. Сосуды для встряхивания помещали на вращающее устройство, инкубировали при 37^oС и поддерживали в виде суспензионной культуры путем осторожного вращения со скоростью 90-110 оборотов/минуту. Влияние полиола плюроник F-68 (0,1%), обозначенного ниже как F-68, и сульфата меди (50 нМ) на продукцию фактора VIII исследовали в сосудах для встряхивания. Фактор VIII определяли количественно хромогенным анализом. Реагенты для анализа коммерчески доступны в виде тест-набора, известного под названием Коатест VIII: C/4, который поставляется фирмой Бэкстер Хелс Кэер Продактс. Таким способом клетки поддерживались в течение 24 дней. Активность фактора VIII в каждой из сред, определенная с помощью Коатест VIII:C/4, приведена в табл. 1.

Увеличение концентрации до 0,3% не оказало значительного влияния на образование фактора VIII. Дозо-зависимые эксперименты показали, что для образования фактора VIII оптимальной является концентрация сульфата меди 50-800 нМ.

Как показано в табл. 1, в условиях отсутствия белка добавление одного плюроника F-68 или, предпочтительно, в комбинации с сульфатом меди значительно повышает титр и специфическую продуктивность клеток ВНК, содержащих ген, кодирующий фактор VIII.

Пример 2
С целью дальнейшей оптимизации процесса получения фактора VIII в условиях, при которых отсутствует белок, к среде добавляли микроэлементы. Образование фактора VIII оценивали, используя установку с непрерывно встряхивающимися культуральными сосудами, как описано в примере 1, в течение 16 дней. Данные приведены в табл. 2. В отсутствие сульфата меди микроэлементы не оказывали влияния на продукцию фактора VIII.

Пример 3
Влияние микроэлементов и меди на продукцию фактора VIII изучали в перфузионном ферментере. Два ферментера по 1,5 л каждый засевали клональным вариантом клеток ВНК с плотностью 2•10⁶ клеток/мл, используя базальную среду, описанную в табл. 1. Ферментер перфузировали со скоростью 0,5 л/день. Один ферментер служил контролем, в другой добавляли соль меди и микроэлементы, как описано в табл. 2. В ферментерах поддерживали плотность клеток на уровне примерно 2-3•10⁶ клеток/мл в течение 15 дней. Как показано в табл. 3, в отсутствие белка добавление плюроника F-68, меди и микроэлементов в условиях непрерывной перфузии значительно усиливало специфическую продуктивность клеток ВНК, содержащих ген, кодирующий фактор VIII. Этот способ может быть легко адаптирован к большим ферментерам (200-500 л), снабженным удерживающим клетки устройством, таким как сепаратор.

Вышеприведенные примеры являются лишь иллюстрацией и не рассматриваются как ограничение настоящего изобретения, область применения которого определяется формулой изобретения.

Источники информации
Bihoreau N. и др., Eur. J. Biochem. 222:41-48 (1994).

Chan S.Y, US Pat. No 5576194 (1996).

Eis-Hubinger A.M. и др., Thronb. Haemost. 76: 1120 (1996).

Mizrahi A., J. Clin. Microbiol. 11-13 (1975).

Murhammer D.W, и др., Biotechnol. Prog. 6: 142-148 (1990).

Papoutsakis E.T., Trends in Biotechnology (Tibtech) 9: 316-324 (1991).

Qi Y-M. и др., Cytotechnology 21:95-109 (1996).

Schmolka I.R., J. Am. Oil Chem. Soc. 54:110-116.

Schneider Y-J., J. Immunol: Meth. 116:65-77 (1989).

Wood W. и др.. Nature 312:330-337 (1984).

Хu D. и др., China J. Biotech. 11:101-107(1995).

Zhang J. и др.. Biotechnol. 33:249-258 (1994).

Изобретение относится к области биотехнологии. Рекомбинантный фактор VIII получают из клеток млекопитающих путем культивирования клеток в среде, не содержащей белка, с добавлением полиольных сополимеров, предпочтительно в присутствии микроэлементов, таких как медь. Среда для получения рекомбинантного фактора VIII содержит полигликоль, известный как плюроник F-68, сульфат меди, комплекс сульфата железа с этилендиаминтетрауксусной кислотой и соли микроэлементов, таких как марганец, молибден, кремний, литий и хром. Способ позволяет усилить образование фактора VIII и снизить опасность его инфицирования. 2 с. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения рекомбинантного фактора VIII, включающий культивирование клеток-хозяев млекопитающих, содержащих ген, кодирующий фактор VH1, выделение рекомбинантного фактора VIII и, при необходимости, его очистку, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в присутствии полиолов и ионов меди в среде, свободной от происходящего от плазмы белка.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полиола используют Pluronic F-68 в концентрации от примерно 0,025 до примерно 0,2% от веса среды.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионы меди добавляют в форме сульфата меди, используемого в количестве от примерно 50 до примерно 800 нмоль.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в среде, дополнительно содержащей ионы марганца в количестве от примерно 1,5 до примерно 4,5 нмоль.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в среде, дополнительно содержащей ионы молибдена в количестве от примерно 1,5 до примерно 4,5 нмоль.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в среде, дополнительно содержащей ионы кремния в количестве от примерно 75 до примерно 300 нмоль.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в среде, дополнительно содержащей ионы хрома в количестве от примерно 1,0 до примерно 4,0 нмоль.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в среде, дополнительно содержащей ионы лития в количестве от примерно 120 до примерно 480 нмоль.9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве клеток-хозяев млекопитающего используют клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток почки новорожденного хомяка, человеческих эмбриональных клеток почки и клеток яичника китайского хомяка.10. Рекомбинантный фактор VIII, полученный в соответствии со способом по п.1, при этом он свободен от белка, происходящего от плазмы.11. Культуральная среда для получения рекомбинантного фактора VIII, содержащая базальную среду и клетки млекопитающих, содержащих ген, кодирующий фактор VIII, отличающаяся тем, что базальная среда содержит полиол в концентрации от примерно 0,025 до примерно 0,2% от веса среды и ионы меди в количестве от примерно 50 до примерно 800 нмоль, при этом среда свободна от белка, происходящего от плазмы.12. Культуральная среда по п.11, отличающаяся тем, что дополнительно содержит, по меньшей мере, один микроэлемент, выбранный из группы, состоящей из марганца, молибдена, хрома и лития.13. Культуральная среда по п.11, отличающаяся тем, что дополнительно содержит рекомбинантный инсулин.