СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОБИОЗА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской паразитологии, и может быть использовано при выявлении яиц остриц (Enterobius vermicularis) у взрослых и детей.

В лабораторной практике в педиатрии, терапии и инфекционных болезней для диагностики энтеробиоза используют методы: соскоба с перианальных складок с помощью деревянного или целлофанового шпателей, протирания ватным тампоном; исследование ректальной слизи, метод Гиммельфарба, исследование подногтевых пространств и ногтей, метод Грехема - отпечаток на клейкую ленту с последующим просмотром препаратов в световой микроскоп (А.Я. Лысенко, А.А. Красильников // Лабораторные методы диагностики паразитарных болезней. М., 1999, 59 с. ; В. П.Подъяпольская, В.Ф.Капустин // Глистные болезни человека. М., 1958, стр. 390-393 и 436-639).

Недостатки метода: при исследовании соскобов и смывов при световой микроскопии возможны диагностические ошибки, обусловленные, с одной стороны, нахождением различных включений и образований, напоминающих яйца остриц, но не принадлежащие гельминтофауне (споры съедобных грибов, растительные элементы, яйца мучного и сырного клещей); с другой стороны, изменение формы яиц других гельминтов, напоминающие яйца остриц (недоразвитие яиц, наличие яиц псевдопаразитов); в-третьих - отсутствие ассиметрии (дифференциального признака яйца острицы) при расположении яиц остриц на уплощенной стороне.

Перечисленные выше включения, образования и элементы пищи неопытным лаборантом не будут учтены и могут привести к постановке ошибочного диагноза.

Изобретение направлено на решение задач:
- повышение специфичности диагностики энтеробиоза;
- достоверного контроля за эффективностью лечения этого гельминтоза.

Выполнение поставленных задач достигается за счет нМФА - непрямого метода флюоресцентного анализа: с помощью применения специфической иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации морских свинок яйцами остриц. Прореагировавшие с яйцами остриц специфические антитела морской свинки выявляют путем окраски флуоресцирующими иммуноглобулинами против иммуноглобулинов морской свинки. На предметном стекле образуется комплекс, состоящий из яиц остриц + немеченых антител морской свинки к яйцам остриц + флуоресцирующих антител к иммуноглобулинам морской свинки. Полученный препарат просматривают в люминесцентном микроскопе.

При наличии в препаратах флуоресцирующих яиц остриц диагностируют энтеробиоз.

Способ осуществляют следующим образом: на фиксированную на предметном стекле скотч-пленку с отпечатками кожи с перианальных складок наносят 20 микролитров сыворотки морской свинки к яйцам остриц в разведении 1:40. Стекла с мазками помещают во влажную камеру, которую выдерживают в течение 20 мин при температуре 37^oС. Затем отпечатки промывают в забуференном физиологическом растворе рН 7,4 (ЗФР) дважды по 7 мин и удаляют капли раствора с помощью фильтровальной бумаги.

После этого на отпечаток наносят 20 микролитров флуоресцирующих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов морской свинки, взятых в рабочем разведении 1: 16. Предметные стекла с отпечатками помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 20 мин при температуре 37^oС. Затем предметные стекла с мазками вновь дважды по 7 мин промывают в ЗФР и удаляют капли фильтровальной бумагой.

Высушенные препараты просматривают под иммерсионным объективом.

При наличии яркой флуоресценции зеленого цвета двухслойной оболочки яиц со следующими характерными морфологическими признаками: яйцо продолговатой несколько ассиметричной формы (с уплощенной одной стороной), с гладкой поверхностью и размерами в диапазоне 0,052-00,06 • 0,02-0,03 мм, диагностируют энтеробиоз.

При отсутствии яиц остриц такая флуоресценция не наблюдается.

Постановка реакции должна сопровождаться следующими контролями:
1. Положительный контроль - яйца остриц + немеченая сыворотка к яйцам остриц + флуоресцирующий антивидовой конъюгат. Наблюдается специфическая флуоресценция яиц остриц.

2. Отрицательный контроль - отпечаток с кожи плеча больного + немеченая сыворотка к яйцам остриц + флуоресцирующий антивидовой конъюгат. Специфическая флуоресценция отсутствует.

3. Контроль флуоресцирующего конъюгата - яйца остриц + ЗФР + флуоресцирующий антивидовой конъюгат. Специфическая флуоресценция отсутствует.

Продолжительность постановки реакции 1ч 20 мин.

Пример 1.: Больная Н., 9 лет. Находилась на лечении в детском гельминтологическом центре (ДГКИБ 3 г.Пермь) в ноябре 2000 г.

Диагноз: Лямблиоз, сопутствующий диагноз: энтеробиоз.

Жалобы: на боли в животе в околопупочной области, тошнота, избирательный аппетит.

Анамнез жизни: от второй беременности и вторых срочных родов. Грудное вскармливание до конца 1 года. Перенесенные заболевания: Ветряная оспа, Краснуха, ОРВИ до 4 раз в год.

Объективные данные: Телосложение нормальное. Кожные покровы бледные, чистые. Тени под глазами. Слизистые бледно-розовые. Дыхание везикулярное. Тоны сердца ритмичные, звучные. Живот мягкий, умеренная болезненность в околопупочной области. Печень + 0,5 см ниже края реберной дуги. Диурез сохранен. Стул нормальный.

Общий анализ крови: Эритроциты - 4,4•10¹²/л; Гемоглобин - 133 г/л; Лейкоциты -3,7•10⁹/л; Эозинофилы - 14%; Палочк. - 1%; Сегмент. - 40%, Лимф. - 36%, Моноциты - 9%, СОЭ - 3 мм/ч.

Исследование соскоба с перианальных складок на энтеробиоз непрямым методом флуоресцирующих антител (нМФА): 1-4 яйца остриц в поле зрения. Исследование соскоба с перианальных складок на энтеробиоз по методу Грехема: обнаружены яйца остриц.

Пример 2. Больной П., 3 года 9 мес. Был обследован в поликлинике ДГКИБ 3 г.Пермь в ноябре 2000 г.

Диагноз: Энтеробиоз.

Жалобы: отсутствовали.

Анамнез жизни: Родился недоношенным. На первом году жизни ранние проявления атопического дерматита. Часто болеет ОРВИ.

Объективные данные: Телосложение нормальное. Кожные покровы бледные, чистые. Слизистые бледно-розовые. Дыхание везикулярное. Тоны сердца ритмичные, звучные. Живот мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Диурез сохранен. Стул нормальный.

Общий анализ крови: Эритроциты - 4,4•10¹²/л; Гемоглобин - 127 г/л; Лейкоциты -8,1•10⁹/л; Эозинофилы - 2%; Палочк. - 1%; Сегмент. - 69%, Лимф. - 25%, Моноциты - 3%, СОЭ - 10 мм/ч.

Исследование соскоба с перианальных складок на энтеробиоз непрямым методом флуоресцирующих антител (нМФА): от 1 до 8 яиц остриц в поле зрения.

Исследование соскоба с перианальных складок на энтеробиоз по методу Грехема: обнаружены яйца остриц.

Пример 3.: Больная К., 8 лет. Находилась на лечении в ДГКИБ 3 г.Пермь в ноябре 2000 г.

Диагноз: ОРВИ (парагрипп), сопутствующий диагноз: энтеробиоз.

Анамнез жизни: от первой беременности и первых срочных родов. Грудное вскармливание до 6 мес. Перенесенные заболевания: частые ОРВИ.

Жалобы: на влажный кашель.

Объективные данные: Телосложение нормальное. Кожные покровы бледные, чистые. Гиперемия зева. Дыхание жесткое. Тоны сердца ритмичные, звучные.

Живот мягкий, безболезненный. Печень + 0,5 см ниже края реберной дуги. Диурез сохранен. Стул нормальный.

Общий анализ крови: Эритроциты - 4,2•10¹²/л; Гемоглобин - 125 г/л; Лейкоциты -5,0•10⁹/л; Эозинофилы - 1%; Палочк. - 2%; Сегмент. - 24%, Лимф. - 70%, Моноциты - 3%, СОЭ - 2 мм/ч.

Исследование соскоба с перианальных складок на энтеробиоз непрямым методом флуоресцирующих антител (нМФА): 1 - 4 яйца остриц в поле зрения.

Исследование соскоба с перианальных складок на энтеробиоз по методу Грехема: яйца остриц не обнаружены.

Положительный результат данной методики заключается в высокой специфичности полученных результатов по сравнению с методом - прототипом, так как использование немеченой иммунной сыворотки к яйцам остриц обеспечивает выявление только яиц остриц и не окрашивает включения и образования, по форме напоминающие яйца остриц. Предлагаемый метод обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять единичные яйца гельминта, что в свою очередь позволяет осуществлять достоверный контроль за качеством проведенного лечения.

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской паразитологии. Способ обеспечивает повышение специфичности диагностики энтеробиоза и достоверного контроля за эффективностью лечения. На произведенный с помощью скотч-пленки соскоб с перианальных складок наносят сначала специфические антитела сыворотки морской свинки, затем флуоресцирующий антивидовой конъюгат, после чего препарат просматривают в люминесцентном микроскопе и при наличии флюоресценции зеленого цвета яиц остриц определяют энтеробиоз.

Способ диагностики энтеробиоза путем исследования соскоба с перианальных складок с помощью скотч-пленки, отличающийся тем, что на скотч-пленку наносят сначала специфические антитела сыворотки морской свинки, затем флуоресцирующий антивидовой коньюгат, после этого препарат просматривают в люминесцентном микроскопе и при наличии флюоресценции зеленого цвета яиц остриц определяют энтеробиоз.