СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/552 G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии и может быть использовано для выявления пищевой аллергии у взрослых и детей.

В аллергологии для диагностики пищевой аллергии используют различные серологические реакции, наиболее распространенной является метод иммуноферментного анализа (ИФА) (Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Воронкин Н.И., Сорочинская Н. Н. , Райкис Б.Н. Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения аллергенспецифических lgE-антител // ЖМЭИ, 1987. -N 9. -С. 33-35.).

Недостатки: метод многостадийный, продолжительный по времени, требует применения дорогостоящих тест-систем и использования реагентов, содержащих сильнодействующие или ядовитые вещества. Использование в ИФА значительного числа ингредиентов влияет на специфичность иммуноферментного анализа ("Оптимизация некоторых параметров, позволяющих улучшить сорбционную активность планшет для твердофазного иммуноферментного анализа" Мешандин А.Г., Минасян Б. О. , Ванеева Л.И., Симонов В.П., Агапкина Н.П. ЖМЭИ, 1991, N 3, с. 60-61).

Изобретение направлено на решение задачи: повышение специфичности; уменьшение времени проведения анализа; удешевление способа. Указанная задача достигается за счет использования непрямого метода флуоресцирующих антител, который отличается тем, что пищевые аллергены представляют собой формализированные и танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные пищевыми белковыми антигенами, а меченные анти-lgЕ-антитела получены путем конъюгации анти-lgE-антител с красителем - изотиоционатом флуоресцеина. Полученный комплекс исследуют в люминисцентном микроскопе и при наличии специфического флуоресцирующего ободка на эритроцитах определяют пищевую аллергию.

Способ осуществляют следующим образом: на фиксированные на предметном стекле мазки из пищевых аллергенов (по 8 мазков из одного аллергена на одном предметном стекле) наносят по 10 мл последовательных разведений исследуемых сывороток от 1:10 до 1:1280. Стекла с мазками помещают во влажную камеру и выдерживают 20 мин при 37^oC. По истечении срока инкубации предметные стекла с мазками промывают в ЗФР (забуференный физ. раствор) дважды по 7 мин и удаляют капли раствора с помощью фильтровальной бумаги. На все мазки наносят флуоресцирующие анти-lgE-антитела в объеме 10 мл, взятые в рабочем разведении. Предметные стекла помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 20 мин при 37^oC. Затем предметные стекла с мазками вновь дважды промывают в ЗФР по 7 мин, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионным объективом люминисцентного микроскопа.

При наличии в сыворотке аллергенспецифических lgE-антител к соответствующим пищевым аллергенам наблюдается специфическая флуоресценция эритроцитов в виде ободка.

Оценку интенсивности флуоресценции проводят по четырехкрестовой шкале:
4+ изумрудная зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
3+ яркая зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
2+ зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
1+ слабая, едва заметная флуоресценция ободка вокруг эритроцита;
- отсутствие флуоресценции.

За титр исследуемой сыворотки принимается максимальное ее разведение, в котором наблюдается флуоресценция не ниже, чем на 3+.

Определение в исследуемой сыворотке анти-lgE-антител в титре 1:40 и более указывает на наличие аллергии к данному пищевому аллергену.

Постановка реакции должна сопровождаться нижеследующими контролями.

1) Заведомо положительный контроль: аллерген + стандартная сыворотка к данному аллергену с известным титром + флуоресцирующие анти-lgE-антитела. Титр сыворотки должен подтвердиться.

2) Заведомо отрицательный контроль: ФТЭ барана (формализированные и танизированные эритроциты) + исследуемая сыворотка + флуоресцирующие анти-lgE-антитела. Флуоресценция отсутствует.

3) Контроль конъюгата: аллерген + флуоресцирующие анти-lgE-антитела в рабочем разведении. Флуоресценция отсутствует.

Продолжительность реакции - 1 час 10 мин.

Пример 1. Больная Ч., 5 лет. Диагноз: Атопический дерматит, ограниченный.

Из анамнеза: страдала аллергическим диатезом с 1,5 месячного возраста, впервые изменения на коже появились в связи с употреблением в пищу молочных смесей. В возрасте 1 года аллергический диатез трансформировался в атопический дерматит.

Объективно: отмечается сухость кожных покровов и экскориации на разгибательных поверхностях плеч и предплечий, в подколенных ямках, на шее и периорбитальной области выражен кожный зуд.

Определяли аллергенспецифические lgE-антитела с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител. Использовали пищевые аллергены молока, куриного мяса, белка и желтка куриного яйца. Результат обследования: выявлены аллергенспецифические lgE-антитела к аллергену молока в титре 1:160, что указывает на наличие пищевой аллергии. Полученный результат подтвержден методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Больной М., 10 лет. Диагноз: Нейродермит, ограниченный.

Из анамнеза: впервые изменения на коже появились в 6-месячном возрасте. До 3-х летнего возраста страдал аллергическим диатезом, затем заболевание трансформировалось в нейродермит.

Объективно: отмечается сухость кожных покровов, лихенизация и экскориации в области локтевых сгибов и в подколенных ямках, кожный зуд.

Определяли аллергенспецифические lgE-антитела с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител. Использовали пищевые аллергены молока, куриного мяса, белка и желтка куриного яйца. В результате обследования выявлены аллергенспецифические lgE-антитела к аллергену куриного мяса в титре 1:640, что указывает на этиологическую роль данного аллергена в развитии заболевания. Полученный результат подтвержден методом иммуноферментного анализа.

Пример 3. Больной С., 7 лет, обследован по поводу бронхиальной астмы.

Из анамнеза: с 3-х месячного возраста до 3-х лет страдал аллергическим диатезом, в возрасте 3-х лет кожные проявления аллергии исчезли, появились эпизоды затрудненного дыхания. В возрасте 4-х лет поставлен диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, легкая. Объективно: кожные покровы чистые, физиологической окраски, умеренно влажные. Перкуторный звук над всей поверхностью легких ясный, легочный, в легких дыхание везикулярное, хрипов нет.

Определяли аллергенспецифические lgE-антитела в сыворотке крови с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител. Использовали пищевые аллергены молока, куриного мяса, белка и желтка куриного яйца. В сыворотке больного выявлены аллергенспецифические lgE-антитела к аллергену желтка куриного яйца в титре 1: 320, что указывает на наличие аллергии к данному пищевому аллергену. Полученный результат подтвержден методом иммуноферментного анализа.

Пример 4. Больному А., 14 лет, проведено аллергологическое обследование в связи с подозрением на аллергическую патологию респираторного тракта.

Из анамнеза: в феврале 1997 года переболел пневмонией, после чего в течение двух месяцев сохраняется сухой кашель.

Объективно: грудная клетка правильной формы. Частота дыхательных движений 18 в 1 мин. Перкуторный звук над всей поверхностью легких ясный, легочный. В легких выслушивается жесткое дыхание, хрипов нет.

Исследовали сыворотку на содержание аллергенспецифических lgE-антител с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител. Использовали пищевые аллергены молока, куриного мяса, белка и желтка куриного яйца. В результате обследования в сыворотке больного аллергенспецифических lgE-антител выявлено не было, что исключает аллергическую природу заболевания. При исследовании сыворотки методом иммуноферментного анализа также был получен отрицательный результат.

Противопоказаний для данного способа исследования нет.

Положительный эффект данной методики заключается в снижении экономических затрат, сокращении времени проведения реакции, большей специфичности исследования по сравнению с методом-прототипом, так как, во-первых, аллерген, сенсибилизированный на эритроцитах, представляет собой высокоочищенный белковый препарат, и, во-вторых, значительно сокращено количество реагентов в реакции.

Изобретение относится к медицине, а именно, аллергологии и может быть использовано для выявления пищевой аллергии у взрослых и детей. Способ основан на непрямом методе выявления флуоресцирующих антител. При реализации способа осуществляют контактирование аллергенспецифических JgE-антител сыворотки крови с меченными анти-JgE-антителами. При этом в качестве пищевых аллергенов используют формалинизированные и тонизированные эритроциты барана, сенсибилизированные пищевыми белковыми антигенами. В качестве меченных анти-JgЕ-антител используют коньюгат анти-JgЕ-антител с изотиоцианатом флуоресцеина. Полученный комплекс исследуют в люминесцентный микроскоп. При наличии специфического флуоресцирующего ободка на эритроцитах, а именно при определении в исследуемой сыворотке титра анти-JgЕ-антител 1:40 и выше, диагностиоуют пищевую аллергию. Способ позволяет повысить специфичность, уменьшить время проведения исследования, сократить расходы на его проведение.

Способ диагностики пищевой аллергии путем взаимодействия аллергенспецифических JgE-антител сыворотки крови с пищевыми аллергенами и меченными анти-JgE-антителами, отличающийся тем, что в качестве пищевых аллергенов используют формалинизированные и танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные пищевыми белковыми антигенами, а в качестве меченных анти-JgE-антител используют конъюгат анти-JgE-антител с красителем-изотиоцианатом флуоресцена, полученный комплекс исследуют в люминесцентный микроскоп и при наличии специфического флуоресцирующего ободка на эритроцитах, а именно, при определении в исследуемой сыворотке анти-JgE-антител в титре 1:40 и более диагностируют пищевую аллергию.