СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭУБИОТИКА БИОСПОРИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения эубиотика биоспорина, предназначенного для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, а также дисбактериозов, обусловленных этиологически разнородными факторами (инфекциями, антибиотике и химиотерапией, ионизирующими излучениями, острыми и хроническими интоксикациями и др.).

Уровень техники. Эубиотик биоспорин разработан и запатентован Институтом микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины (патенты РФ N 1722502 и Украины N 689). Препарат представляет собой микробную массу сублимационно высушенных с добавлением сахарозо-желатиновой защитной среды живых антагонистически активных штаммов Bacillus subtilis ВКПМ N В-2335 и B. licheniformis ВКПМ N В-2336. Препарат выпускается Днепропетровским АО "Днепрофарм" (Украина) в ампулах, содержащих 1, 2 или 10 доз (в одной дозе: от 1 до 8 млрд. клеток B.subtilis и от 0,1 до 2,0 млрд. клеток B.licheniformis). Биоспорин разрешен к применению в России приказом Министра здравоохранения РФ N 353 от 29.12.1992 г. (Приложение I, п.1б); ВФС 42-366ВС-92 и "Инструкция по применению..." для биоспорина утверждены 01.12.1992г. В данном препарате сочетаются свойства двух взаимодополняющих штаммов непатогенных аэробных спорообразующих бактерий, обладающих по сравнению с другими используемыми в отечественных и зарубежных биотехнологиях выпуска эубиотиков медицинского и ветеринарного назначения антагонистически активными бактериями (L. acidophilus, B.bifidum, E.coli М-17, B.species JP 5832, B.subtilis 534, L. plantarum, L.casei и др.) уникально высокими уровнями и спектром синтеза биологически активных веществ (антибиотики, интерферон, ферменты, иммуномодуляторы, аминокислоты, витамины и т.д.). Тем самым обеспечивается, с одной стороны, достаточно сложный, многозвенный и разнонаправленный механизм действия и, с другой стороны, - высокая лечебно-профилактическая эффективность биоспорина при острых и хронических инфекциях человека и дисбактериозах различной степени тяжести, в том числе и у детей (включая новорожденных).

Принятый способ получения биоспорина основывается на использовании живых антагонистически активных непатогенных спорообразующих бактерий B.subtilis и B. licheniformis, выращенных в течение 7-12 сут в посевных биологических матрацах на поверхности агаризованных питательных сред (сусло-агаре, обогащенном мясным гидролизатом и микроэлементами Mn⁺⁺ и Cu⁺⁺; мясопептонном агаре и др. ). Микробную массу каждого вида бактерий снимают отдельно с помощью шпателя и 0,85% раствора хлорида натрия, определяют число клеток и соединяют между собой в известном соотношении полученные суспензии, добавляя заданное прописью препарата количество сахарозо-желатиновой защитной среды высушивания. Затем стабилизированную микробную суспензию разливают в ампулы по 1 см³, замораживают при -40^oC в течение 24 ч и лиофилизируют в течение 36 ч до остаточной влажности 3-4%. После завершения процесса высушивания ампулы с готовым биоспорином герметизируют в асептических условиях запаиванием. По результатам оценки соответствия качества готового препарата требованиям ВФС 42-366ВС-92 составляют паспорт на каждую серию и упаковывают.

Данный способ получения биоспорина малопроизводителен и низкорентабелен прежде всего за счет поверхностного способа выращивания бактерий на плотных питательных средах (значительный объем операций с использованием ручного труда, большая продолжительность технологического цикла, применение дефицитных и дорогостоящих компонентов сред, стеклянных посевных матрацев и т.д.). Эти и другие причины не позволяют создать производственные мощности по выпуску биоспорина в количествах, обеспечивающих возрастающие потребности в нем здравоохранения Украины, а тем более экспорт в другие государства (прежде всего в Россию, где данный эубиотик официально разрешен к применению в медицинской практике).

Сущность изобретения. Предлагаемый принципиально новый способ получения биоспорина не ухудшает его качества (лечебно-профилактической эффективности и характеристик, указанных в "Инструкции по применению..." и ВФС 42-366ВС-92) и заключается в следующем.

Вместо применения для получения биоспорина поверхностно выращенных антагонистически активных бактерий B.subtilis и B.licheniformis предлагается использовать глубинные культуры этих микроорганизмов.

Реализация этого способа получения препарата осуществлена посредством экспериментально-аналитического обоснования стадий, процессов и параметров новой технологии выпуска биоспорина с заключительными Государственными клиническими испытаниями под контролем ГИСКа им. Л.А.Тарасевича его лечебно-профилактического действия на добровольцах.

Для глубинного выращивания бактерий B.subtilis и B.licheniformis предложены жидкие питательные среды (ПС) соответствующего компонентного состава на основе недефицитных и относительно дешевых компонентов, сырья и веществ (гидролизата казеина, кукурузного экстракта, соевой муки, мела, крахмала и химических солей).

Основным принципом конструирования этих сред являлось требование обеспечения оптимальных для роста и спорообразования бактерий концентраций азотистых веществ и сахаров, рекомендуемые значения которых составляют:
а) для B.subtilis:
азот аминный - от 0,27 до 0,31 г•дм³;
глюкоза (медицинская или техническая) - от 8 до 14 г•дм³;
б) для B.licheniformis:
азот аминный - от 0,37 до 0,41 г•дм³;
глюкоза (медицинская или техническая) - от 18 до 23 г•дм³.

Кроме того, для обеспечения высокого качества глубинных культур вегетативных и споровых форм антагонистически активных бактерий ПС должны содержать следующие химические соли (соединения), г•дм^-3:
магний сернокислый семиводный - 0,375 (0,800)^*;
железо сернокислое семиводное - 0,001;
марганец сернокислый пятиводный - 0,030 (0,016)^*;
натрий хлористый - 1,000;
кальций хлористый - 0,150;
(^*) - в скобках указаны значения концентраций, рекомендуемые для B.licheniformis.

Для глубинного выращивания B. subtilis используют среды N 1 и N 1С (соево-мело-крахмальная), а для B.licheniformis - N 2.

Указанные среды готовят в специальных варочных котлах, разливают в стеклянные бутыли вместимостью 20 дм³ и деконтаминируют автоклавированием либо же непосредственно в аппаратах-культиваторах (ферментерах) с последующей стерилизацией в них по заданным режимам.

Глубинное культивирование бактерий осуществляют в ферментерах различного объема (0,1; 0,25 м³ и более) типа БИОР-0,1 (КМ-0,1) и БИОР-0,25, оборудованных перемешивающим устройством (магнитной или механической мешалкой), барботером и системами стерилизации фильтрованием подаваемого на аэрацию воздуха, поддержания температуры и соответствующими приборами КИП и А.

Собственно процесс получения глубинных культур бактерий заключается в инокуляции в стерильную среду термоактивированного посевного материала (рабочей культуры) в количестве не менее 0,5 млн. живых бактерий и последующем выращивании культур при температуре (37±1)^oC, постоянном перемешивании (не менее 500 об/мин) и аэрации (соответственно, не менее 0,7 и 0,4 дм³ воздуха/дм³ среды/мин для B.subtilis и B.licheniformis). Контроль роста и спорообразования бактерий в культурах осуществляют по изменению оптической плотности (ОП) при 760 нм, реакции среды (pH), результатам микроскопического (окрашиваемость по Цилю-Нильсену) и биологического (определение числа живых и терморезистентных клеток) анализов.

При достижении глубинными культурами уровня спорообразования не менее 50% процесс выращивания с принудительной аэрацией и перемешиванием прекращают. Оптимальное время выращивания для каждой серии глубинных бактериальных культур индивидуально (определяется экспериментально) и находится в диапазоне от 24-26 до 33-36 ч. После анализа характеристик готовых глубинных культур их охлаждают до температуры не менее 8^oC. Культуры при соответствии их характеристик заданным требованиям должны в течение не более 2 ч быть использованы непосредственно для получения биоспорина (1, 2 дозы) либо же подвергаться дополнительному машинному концентрированию в асептических условиях на сепараторах типа АСГ-ЗМБ или УКВ-202Н-0,1 с последующим ресуспендированием микробного концентрата (пастообразной массы) в изотоничном растворе (0,85%) хлористого натрия. Такие концентрированные микробные культуры затем также подлежат использованию для получения эубиотика (1, 2, 5 и 10 доз).

В обоих предлагаемых вариантах бактерии в глубинных нативных и концентрированных микробных культурах для уменьшения инактивации микроорганизмов при замораживании и сублимации подлежат (как и в аналоге) стабилизации путем использования защитной среды высушивания. В предлагаемом способе получения биоспорина для повышения качества препарата (за счет снижения инактивации при замораживании и дегидратации бактерий, улучшения внешнего вида продукции) и уменьшения производственного брака используется более эффективная защитная среда, что достигается путем дополнительного включения в ее состав сухого обезжиренного молока.

Последующие стадии и операции в предлагаемом нами способе получения лечебно-профилактического препарата (эубиотика биоспорина) не имеют принципиальных отличий от аналога. В частности смесь стабилизированных глубинных микробных культур B.subtilis и B.licheniformis разливается (с учетом требуемого содержания доз) в ампулы либо же в предложенные нами флаконы по 1,0-2,0 см³, замораживается и высушивается в сублимационных сушилках типа LZ-45, МАСС-25 и др. с использованием стандартных режимов дегидратации.

После завершения процесса высушивания и достижения препаратом остаточной влажности в пределах 3-4% ампулы и флаконы с соблюдением требований асептики заполняют аргоном и герметизируют запаиванием или резиновыми пробками с закаткой алюминиевых крышек (колпачков), соответственно. По результатам положительных лабораторных анализов ОБТК составляют паспорта о соответствии препарата требованиям ВФС 42-366ВС-92 и осуществляют упаковку продукции.

Пример 1. Предлагаемый способ получения биоспорина с использованием глубинных культур В.subtilis и B.licheniformis позволяет значительно сократить общую продолжительность технологического цикла от момента посева до выпуска готовой продукции с 10-15 сут до 5 сут за счет существенного уменьшения времени, необходимого для выращивания бактерий и достижения требуемых концентраций микроорганизмов и созревания спор с 7-10 сут - максимально до 36-42 ч. Как видно из сравнительных данных, приведенных в табл. 1, в глубинных культурах урожай бактерий на ПС прописей NN 1 и 1С достигает для B.subtilis соответственно 2,1 и 10,4 млрд. клеток•см³, а для B.licheniformis при выращивании на ПС N 2 - 5,4 млрд. клеток•см³ уже на 2 сут, в то время как при поверхностном выращивании таковой даже на 12 сут составляет всего лишь порядка 1,0-1,2 млрд. клеток•см^-3 (в перерасчете на 1 см^-3 питательной среды). Полученные результаты (см. табл.1) являются подтверждением перспективности и высокой производительности предлагаемого способа, а с учетом использования при его реализации питательных сред на основе дешевого и недифицитного сырья, - его рентабельности.

Кроме того, в зависимости от объемов используемых ферментеров при минимальных затратах на сырье могут быть получены практически любые количества глубинных культур антагонистически активных бактерий (микробной массы). Вследствие этого выпуск биоспорина согласно предлагаемому способу может потенциально обеспечить неограниченные потребности в данном эубиотике как собственно здравоохранения РФ, так и его экспорт.

Пример 2. Глубинные микробные культуры, выращенные в ферментерах КМ-0,1 (БИОР-0,25; БИОР-0,1) с использованием предлагаемых ПС (NN 1, 1С и 7) и соответствующих параметров (условий) культивирования, а также приготовленные из них на сепараторах АСГ-3МБ концентрированные микробные культуры после введения в их состав защитной среды высушивания (сахароза, желатина и сухое обезжиренное молоко) разливали в стеклянные флаконы вместимостью 10 см³ по 1,5 см³ и дегидратировали в сублимационной сушильной установке МАСС-5. Результаты оценки выживаемости бактерий B. subtilis и B.licheniformis при сублимационном высушивании, приведенные в табл.2, свидетельствуют о высокой сохраняемости числа живых (колониеобразующих) микроорганизмов как в нативных, так и в концентрированных микробных культурах после их дегидратации до остаточной влажности 3-4%. Следовательно, предложенный способ обеспечивает получение глубинных микробных культур с высокими биологическими характеристиками, пригодных для последующего концентрирования и высушивания.

Пример 3. Согласно предлагаемому способу получения биоспорина, описанному в соответствующем экспериментально-производственном регламенте, были приготовлены 3 серии эубиотика во флаконах (по 10 доз в каждом). Эти образцы препарата были оценены на соответствие требованиям ВФС 42-366ВС-92 непосредственно после изготовления, а также после 16-месячного хранения при комнатной температуре (18-26^oC). Результаты этого опыта, приведенные в табл.3, свидетельствуют о соответствии характеристик полученного согласно предлагаемому нами новому способу биоспорина требованиям ВФС 42-366ВС-92 как непосредственно после приготовления, так и на изученный срок хранения.

Пример 4. Пациент П., 49 лет. Жалобы на слабость, потливость, диспептические явления, диарею, боли в эпигастральной области живота, возникшие примерно через 5-6 часов после приема плохо промытых ягод клубники. Объективно: температура 39,5^oC; язык обложен сероватым налетом, сухой; при пальпации - болезненность в эпигастральной области живота, а также по ходу толстого кишечника; стул - жидкий, с неприятным запахом, остатками непереваренной пищи, учащенный (через 1-1,5 ч). Диагноз: токсикоинфекция, предположительно сальмонеллезной природы; бактериологического исследования не проводилось по объективным причинам. Антибиотики и химиопрепараты не применялись. Назначен биоспорин по 2 дозы 2 раза в день. Через 5-6 часов наблюдалось определенное улучшение самочувствия больного (уменьшение болей, урчания и частоты стула), снижение температуры до 37,8^oC. Явное улучшение и снижение температуры до нормальной произошло через 2 сут, полное выздоровление - на 3-4 сут. При высеве кала патогенных и условно-патогенных бактерий не обнаружено.

Пример 5. Лечебно-профилактическая эффективность биоспорина, получаемого согласно предлагаемому способу из глубинных микробных культур B.subtilis и B. licheniformis, не уступает таковой препарата, изготовленного из бактерий, выращенных поверхностным способом.

В частности, среди лиц, получивших изготовленный согласно предлагаемому и известному способам биоспорин с профилактической целью (см.табл.4), не регистрировалось заболеваний воздушно- капельными и кишечными инфекциями на протяжении одного месяца после его применения.

Биоспорин, используемый дополнительно к традиционной комплексной терапии больных среднетяжелой формой дизентерии Флекснера 2а, способствовал более ранней нормализации их субъективного состояния за счет уменьшения метеоризма, исчезновения тянущих болей и урчания в животе. Объективно отмечалось положительное влияние препарата на восстановление состава микрофлоры кишечника у реконвалесцентов (см.табл.5).

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения эубиотика биоспорина, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, а также дисбактериозов, обусловленных этиологически разнородными факторами (инфекциями, антибиотико- и химиотерапией, ионизирующими излучениями, острыми и хроническими интоксикациями и др.) Для получения эубиотика биоспорина смешивают микробные биомассы штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-2335 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-2336, полученные глубинным культивированием на питательной среде с содержанием аминного азота от 0,27 до 0,31 и от 0,37 до 0,41 г/дм³ соответственно. Используют также концентрированную биомассу указанных бактерий. Стабилизируют ее сахарозо-желатиновой средой, обогащенной обезжиренным молоком. Обеспечено повышение рентабельности и эффективности производства без ухудшения качества. 5 табл.

Способ получения эубиотика биоспорина, представляющий собой посев спорообразующих штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-2335 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-2336 в питательные среды, раздельное культивирование, смешивание полученных микробных биомасс, их стабилизацию введением сахарозо-желатиновой среды, асептический розлив в ампулы или флаконы и лиофилизацию, отличающийся тем, что смешиванию подвергают полученные глубинным культивированием микробные биомассы штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-2335 на питательной среде с содержанием аминного азота от 0,27 до 0,31 г/дм³ и штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-2336 на питательной среде с содержанием аминного азота от 0,37 до 0,41 г/дм³ или концентрированную биомассу полученных бактерий, при этом сахарозо-желатиновую среду дополнительно обогащают обезжиренным молоком.