КОНЪЮГАТЫ ГЕМОГЛОБИНА С ПОЛИСАХАРИДОМ Российский патент 2004 года по МПК A61K38/42 A61K35/14 A61K31/715 A61P7/00 

Это изобретение относится к биологически совместимым переносчикам кислорода для введения пациентам в качестве добавки или для частичного замещения цельной крови. Более определенно, изобретение относится к переносчикам кислорода на основе гемоглобина (НВОС) для введения млекопитающим в качестве заместителя или добавления объема крови и к способам их получения.

Гемоглобин как естественный компонент крови, транспортирующий кислород, является очевидным кандидатом для образования основы заместителя крови, например, в виде водного раствора. В попытках получения удовлетворительного раствора гемоглобина, действующего в качестве заместителя крови, была проведена обширная научно-исследовательская работа, результаты которой были опубликованы. Однако химические свойства гемоглобина вне эритроцитов существенно отличаются от его свойств внутри эритроцитов, например, в отношении его сродства с кислородом. В течение длительного времени была признана необходимость в некоторой форме химической модификации гемоглобина, для того чтобы сделать его пригодным для применения в качестве заместителя крови, и в этом направлении проводились достаточно интенсивные исследования.

Хорошо известно, что гемоглобин включает в себя тетрамер из четырех субъединиц, а именно две α-субъединицы, каждая из которых имеет пептидную цепь глобина, и две β-субъединицы, каждая из которых имеет пептидную цепь глобина. Тетрамер имеет молекулярную массу приблизительно 64 кДа, и каждая субъединица имеет приблизительно одинаковую молекулярную массу. Тетрамерный гемоглобин в разведенном водном растворе легко диссоциирует на α-β-димеры и далее в тех же условиях - даже до α-субъединичных мономеров и β-субъединичных мономеров. Димеры и мономеры имеют слишком низкую молекулярную массу для удерживания в системе кровообращения организма и фильтруются почками для выделения с мочой. Это приводит к неприемлемо короткому периоду полувыведения такого продукта из организма. Ранее был признан благоприятный эффект химического связывания между субъединицами для обеспечения поддержания тетрамерной формы ("внутримолекулярная поперечная сшивка"). Желательным во многих случаях было признано также связывание вместе двух или более тетрамерных единиц для образования олигомеров и полимеров гемоглобина с молекулярной массой больше чем 64 кДа ("межмолекулярная поперечная сшивка").

Соответственно один подход к разработке НВОС для клинического применения состоял во внутримолекулярной поперечной сшивке единиц гемоглобина в стабилизированные тетрамеры с молекулярной массой около 64 кДа и необязательно в олигомеризации этих тетрамеров в олигомеры из 2-6 таких тетрамеров с помощью межмолекулярной поперечной сшивки. Для этой цели были предложены разнообразные поперечно сшивающие реагенты, включая сахариды с раскрытым при окислении кольцом, такие как о-раффиноза (например, патент США 4857636, выданный Hsia, и патент США 5532352, выданный Pliura et а1.), бифункциональные имидаты, такие как диэтилмалонимидат-гидрохлорид (патент США 3925344, выданный Muzur), галоидированные триазины, дивинилсульфоны, диизоцианаты, глутаральдегид и другие диальдегиды (патент США 4001200, выданный Bonsen et al.), бис-диаспиринэфиры (патент США 5529719, выданный Туе), бис- и трис-ацилфосфаты (патент США 5250665, выданный Kluger et al.) и другие.

Другой подход к получению НВОС с соответствующей молекулярной массой для клинического применения состоял в соединении гемоглобина с биологически совместимым полисахаридом. Такие конъюгаты имели бы преимущество по сравнению с поперечно сшитыми и олигомеризованными гемоглобинами, требуя меньших количеств гемоглобина на единицу НВОС, а следовательно, их получение было бы более экономичным и снизило бы связанную с гемоглобином токсичность. Конъюгация коллоида с гемоглобином при получении НВОС также обеспечивает возможность регулирования жидкостных свойств, таких как вязкость и коллоидно-осмотическое давление, с помощью подбора размера коллоида, степени его модификации и соотношения между коллоидом и гемоглобином. Эти же показатели могут применяться для регулирования конечной молекулярной массы и времени удерживания продукта в сосудистой системе.

В патенте США 4064118, выданном Wond, предложено получение заместителя крови или наполнителя крови с помощью химического соединения гемоглобина с полисахаридным материалом, выбранным из декстрана и гидроксиэтилкрахмала с молекулярной массой приблизительно от 5 до 2000 кДа. Однако в этом патенте приведен только пример применения декстрана.

В статье Baldwin et al. , "Tetrahedron" 37, рр. 1723-1726 (1981), "Synthesis of Polymer-Bound Hemoglobin Samples", описана химическая модификация декстрана и гидроксиэтилкрахмала (HES) для образования полимеров замещенных альдегидов и их последующей реакции с гемоглобином для образования растворимого гемоглобина, связанного с полимером. Хотя образованные таким образом продукты были способны связывать кислород, сообщают о их непригодности для применения в качестве заместителей крови, поскольку их кривые связывания кислорода были значительно смещены влево, указывая на то, что у них имеется слишком высокое сродство к кислороду (слишком низкое Р₅₀).

Задачей настоящего изобретения является предоставление нового НВОС.

Еще одной задачей изобретения является предоставление нового конъюгата полисахарид-гемоглобин, который может применяться в качестве НВОС.

Еще одной задачей изобретения является предоставление способа получения нового конъюгата полисахарид-гемоглобин, который может применяться в качестве НВОС.

В способе настоящего изобретения используется полисахарид в форме с кольцом, раскрытым при окислении. В этой окислительной форме, по меньшей мере, часть мономерных единиц сахарида окислена, представляя собой альдегидные группы. Образованный таким образом окисленный полисахарид затем вступает в реакцию с внеклеточным гемоглобином, так что гемоглобин посредством первичных аминогрупп цепей глобина, вступающих в реакцию с альдегидными группами окисленного полисахарида, ковалентно связывается с полисахаридом посредством связей основания Шиффа. Первоначально и очень быстро в значительных количествах образуется продукт, который включает в себя виды с высокой молекулярной массой, порядка 500 кДа или выше, и с широким распределением молекулярной массы (128->500 кДа).

При поддержании этого продукта в соответствующих условиях в водном растворе он может в контролируемой степени за относительно короткий период (например, 4-48 ч, в зависимости от условий) преобразоваться в продукт с гораздо более низкой молекулярной массой (90-200 кДа) и с гораздо более узким распределением молекулярных масс. Оказывается, что этот продукт после химического восстановления для восстановления связей основания Шиффа между гемоглобином и полисахаридом во вторичные аминные связи имеет такие свойства, как сродство к кислороду, в диапазоне P₅₀ от 4 до 50 мм рт. ст. при 37^oС, в зависимости от лигандного состояния гемоглобина во время сопряжения связей, которое делает его крайне подходящим в качестве кандидата в переносчики кислорода на основе гемоглобина для клинического применения у млекопитающих. Степень трансформации можно регулировать с помощью определения времени применения этапа восстановления. Кроме того, полученный в результате продукт не содержит не вступивший в реакцию выявляемый гемоглобин, который в случае присутствия подвергался бы диссоциации с образованием αβ-димеров, вызывающих, как предполагают, повреждение почек, и не содержит выявляемых количеств продуктов с избыточно высокой молекулярной массой (приблизительно свыше 500-600 кДа).

Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предоставляется конъюгат полисахарид-гемоглобин, который можно применять в качестве переносчика кислорода на основе гемоглобина и который имеет сродство к кислороду, выражаемое в виде парциального давления кислородной среды, требуемой для поддержания 50% насыщения кислородом, Р₅₀ = 4-50 мм рт. ст. при 37^oС, и не содержит невыявляемый остаточный несвязанный гемоглобин, и не содержит выявляемых остаточных количеств компонентов с молекулярной массой выше примерно 500 кДа, причем указанные конъюгаты получены путем реакции гемоглобина с окисленным полисахаридом для образования комплекса конъюгатов с высокой молекулярной массой, позволяя комплексу высокомолекулярных конъюгатов распадаться при хранении в растворе при подходящей величине рН, легко определяемой с помощью простых, обычных экспериментов, и образовывать указанный конъюгат полисахарид-гемоглобин при температуре от 2^oС до приблизительно 45^oС.

Еще один аспект изобретения связан с конъюгатом полисахарид-гемоглобин, который можно применять в качестве переносчика кислорода, включающим в себя гемоглобин, ковалентно связанный посредством вторичных аминных связей из аминогрупп на гемоглобине с остатками альдегидных групп на полисахариде, причем указанные альдегидные группы образованы путем раскрытия при окислении кольца сахаридных мономерных единиц полисахарида.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение связано со способом получения переносчика кислорода на основе гемоглобина, который включает в себя проведение реакции между подвергнутым раскрытию при окислении кольца полисахаридом, несущим альдегидные группы, и гемоглобином с образованием конъюгата со связями основания Шиффа, обеспечивающей возможность конъюгату находиться в условиях, которые влияют на уменьшение молекулярной массы конъюгата, стабилизируя конъюгат путем восстановления связей основания Шиффа до устойчивых вторичных аминных связей, и извлечение раствора образованного таким образом конъюгата полисахарид-гемоглобин, который не имеет выявляемого несвязанного остатка гемоглобина и не имеет выявляемого остатка продукта с молекулярной массой приблизительно более 500-600 кДа.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1, 2 и 3 представляют собой наборы хроматограмм продуктов представленного ниже примера 2.

Фиг.4 представляет собой анализ методом гель-фильтрации продуктов представленного ниже примера 3.

Фиг.5 представляет собой аналогичный набор хроматограмм продуктов представленного ниже примера 6.

Фиг.6 представляет собой аналогичный набор хроматограмм продуктов представленного ниже примера 7.

Фиг. 7 и 8 представляют собой аналогичные наборы хроматограмм продуктов представленного ниже примера 8.

Фиг. 9 представляет собой аналогичный набор хроматограмм, иллюстрирующий результаты представленного ниже примера 10.

Фиг. 10, 11 и 12 представляют собой аналогичные наборы хроматограмм продуктов представленного ниже примера 11.

Кажущиеся молекулярные массы, описанные в этой заявке, получены путем сравнения с временем элюции стандартов полимеризованного о-раффинозой гемоглобина (polyOR-Hb) с известной молекулярной массой, полученным методом гель-фильтрации. Поскольку конъюгаты гемоглобин-коллоид, как предполагается, содержат значительные количества захваченной воды в обширном компоненте коллоидной цепи, фактическая молекулярная масса конъюгата, включающего в себя только молекулы, ковалентно связанные с гемоглобином, меньше, чем кажущаяся молекулярная масса. Однако именно кажущаяся молекулярная масса, или исключенный объем, будет определять время удерживания конъюгата in vivo и, таким образом, описанная выше молекулярная масса будет использована для описания указанных здесь конъюгатов.

Гемоглобин, предназначенный для применения в способе настоящего изобретения, предпочтительно представляет собой гемоглобин человека, полученный из эритроцитов. Однако изобретение применимо также для других типов гемоглобина для образования основы заместителя крови, таких как гемоглобины животных, особенно бычий гемоглобин, свиной гемоглобин и им подобные, и гемоглобин, полученный из клеточной культуры. В настоящее время гемоглобин человека является предпочтительным для образования основы заместителя крови для введения человеку.

Гемоглобин для применения в настоящем изобретении может быть выделен и получен в соответствии с известными стандартными методиками. Таким образом, эритроциты подвергают лизису и клеточные фрагменты и строму удаляют из них с помощью стандартных методик центрифугирования, фильтрации и им подобных. Предпочтительно используют раствор гемоглобина с концентрацией от 2 до 20 мас. % гемоглобина для выхода продукта, имеющего наиболее желательный состав и комбинацию свойств. Окончательную очистку можно проводить с помощью хроматографии. Успешно используют способ вытеснительной адсорбционной хроматографии, описанный в патенте США 5439591, выданный Pliura et al.

Гемоглобин может естественно существовать в плотной (Т) конформации, которую обычно принимает дезоксигемоглобин, или в расслабленной (R) конформации, которую обычно принимает оксигемоглобин или монооксидуглеродный гемоглобин. Характеристики связывания кислорода гемоглобином в состоянии Т являются более желательными характеристиками, поскольку сродство к кислороду в этой конформации обеспечивает возможность эффективного связывания кислорода в сосудистой системе легких и отдачу кислорода в периферических тканях. Соответственно в способе согласно изобретению предпочтительно применять дезоксигемоглобин. После конъюгации с гидроксиэтилкрахмалом (HES) с предварительной поперечной сшивкой или без нее дезоксигемоглобин удерживает характеристики связывания кислорода конфигурации Т. Однако, если по какой-либо причине для начала будет выбран гемоглобин конфигурации R, предпочтительный во всех отношениях способ в соответствии с изобретением стабилизирует гемоглобин в конфигурацию R. Смеси гемоглобинов в состоянии R и Т могут вступать в реакцию с HES для получения продуктов со свойствами связывания кислорода, промежуточными между свойствами конфигураций состояния R и Т.

В соответствии с известными методиками, дезоксигенацию гемоглобина для образования дезоксигемоглобина предпочтительно проводят, подвергая раствор гемоглобина обработке неоксигенированным газом, таким как азот. Предпочтительно продолжать обработку потоком азота с последующей соответствующей дегазацией в течение достаточно длительных периодов времени для достижения таким образом полного превращения дезоксигемоглобина.

Полисахариды, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают в себя полисахариды с установленной биологической совместимостью и имеющие сахаридные мономерные единицы, способные к раскрытию кольца при окислении для образования реактивных альдегидных групп. Они включают в себя крахмалы и производные крахмала, декстран, инулин и им подобные. Среди полисахаридов предпочтительными для использования в настоящем изобретении являются крахмал и декстран, причем наиболее предпочтителен HES.

Гемоглобин может вступать в реакцию с окисленным гидроксиэтилкрахмалом в его нативной, не поперечно сшитой, форме или в его поперечно сшитой и олигомеризованной форме, включающей в себя аддукты от 64 до <500 кДа. При использовании в его поперечно сшитой форме предпочтительным поперечно сшивающим реагентом для получения поперечно сшитого и поперечно сшитого олигомеризованного гемоглобина является полиальдегид, полученный в результате раскрытия при окислении кольца олигосахарида, такого как раффиноза (т.е. о-раффиноза). Подходящий способ получения о-раффинозы и ее реакции с гемоглобином описаны в упомянутом выше патенте США 5532352, выданном Pliura et al., описание которого включено сюда в качестве ссылки. Хотя о-раффиноза представляет собой предпочтительный поперечно сшивающий реагент для применения в этом варианте реализации изобретения, он ни в коей мере не ограничен ею. Успешно могут использоваться любые другие известные реагенты, поперечно сшивающие Нb, такие как упомянутые ранее реагенты, например тримезоилметилфосфат (ТММР), описанный в патенте США 5250665, выданном Kluger et al.

Подходящая молекулярная масса исходного материала гидроксиэтилкрахмала для применения в предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения составляет примерно от 70 до 1000 кДа. Он имеется в продаже в различных типах и разновидностях. Для применения в настоящем изобретении тип и разновидность не имеют принципиального значения. В качестве исходного материала может использоваться, по существу, любая из имеющихся в настоящее время в продаже разновидностей HES, при условии, что они имеют молекулярную массу, приблизительно равную представленной выше. Особенно пригодны разновидности с соотношением замещения (т.е. числом, выражающим отношение гидроксиэтиловых групп к единицам глюкозы), составляющим приблизительно от 0,5 до 0,7.

Для получения HES с целью использования в настоящем изобретении его окисляют, с тем чтобы создать на нем существенное количество альдегидных групп. Это может осуществляться с помощью различных способов окисления, причем предпочтительным является реакция с периодатом (натрия или калия). Эта реакция может происходить в водном растворе при низкой температуре, например 0-5^oС, с использованием соответствующего количества периодата натрия, выбранного в соответствии с желательной степенью окисления. Реакция завершается приблизительно через 1-4 ч. Для удаления нежелательных солей и компонентов HES с низкой молекулярной массой можно использовать ультрафильтрацию или диализ, представляя таким образом средство регулирования диапазона молекулярной массы окисленного HES, который предстоит подвергнуть сопряжению связей с Нb. Окисленный HES может использоваться непосредственно или может извлекаться, например, с помощью лиофилизации и повторно растворяться в воде для конъюгации с гемоглобином.

Реакция конъюгации может происходить в водном растворе. Гемоглобин может необязательно представлять собой поперечно сшитый Нb и/или олигомеризованный Нb. Он может быть в виде лиганда, например, с окисью углерода (CO-Hb). Более низкие величины Р₅₀ в конечных продуктах получаются с CO-Hb, более высокие величины - с дезокси-Нb. Молярные соотношения Нb: окисленный HES могут быть приблизительно заключены в диапазоне примерно от 0,25:1 до 5:1, но предпочтительно находятся в приблизительном диапазоне от 0,5:1 до 3:1. Реакция лучше всего происходит при щелочном рН, например в диапазоне от 7,5 до 9, и при комнатной температуре.

При анализе обнаруживается, что независимо от молекулярной массы исходного полисахарида первоначально образованный продукт реакции, т. е. приблизительно через 1 ч, имеет очень высокую молекулярную массу с компонентами, имеющими молекулярную массу, значительно превосходящую 500 кДа. Этот первоначальный продукт также содержит продукты с широким диапазоном молекулярной массы. Вызвать эффект регулируемого уменьшения молекулярной массы продукта до продукта, не содержащего компоненты с молекулярной массой примерно выше 500000, и до продукта с узким распределением молекулярной массы (например, преимущественно содержащего виды с молекулярной массой от 100 до 200 кДа), можно с помощью поддержания продукта в водном растворе, предпочтительно при приблизительном диапазоне рН от 7,2 до 10 и при комнатной температуре (15-30^oС) или близкой к ней в течение периода времени приблизительно до 48 ч. Имеется очень мало остаточных видов с молекулярной массой 32 кДа, если они вообще остаются. Количество видов с молекулярной массой 32 кДа так мало, что нет необходимости в специальных этапах для их удаления.

Образованный таким образом конъюгат должен быть стабилизирован с помощью восстановления (обратимых) связей основания Шиффа между Нb и HES в устойчивые вторичные аминные связи и с помощью восстановления любых не вступивших в реакцию альдегидных групп. Восстановление может осуществляться в один этап, при котором связи основания Шиффа и альдегидные группы восстанавливаются в один этап или в два отдельных этапа. При одном этапе эффективными будут мощные восстанавливающие средства, причем менее мощные восстанавливающие средства требуют двухэтапного процесса.

Этот этап восстановления предпочтительно используется в качестве средства регулировки молекулярной массы и распределения молекулярной массы конечного продукта с помощью выбора для него соответствующего времени. Как только восстановление завершено, продукт стабилизируется, и при хранении не происходят дальнейшие сколько-нибудь значимые изменения молекулярной массы или распределения молекулярной массы. Соответственно анализ образцов продукта реакции через интервалы времени позволяет установить время этапа восстановления для стабилизации продукта при выбранных характеристиках.

Предпочтительным выбором в качестве восстанавливающего средства является диметиламинбор. Он обладает достаточной мощностью для осуществления обеих реакций восстановления в один этап. Могут также использоваться другие растворимые в воде восстанавливающие средства из низших алкиламинборов, включая трет-бутиламинбор, аммонийную соль бора; диметиламинбор; триметиламинбор; триэтиламинбор и пиридинбор, но не ограничиваются ими. Другими восстанавливающими средствами, которые могут использоваться, являются цианоборогидрид натрия и борогидрид натрия.

Наиболее целесообразно, если восстановление оснований Шиффа, образованных во время сопряжения связей, и восстановление любых остаточных не вступивших в реакцию альдегидных групп происходит в водном растворе в диапазоне температур от 2 до 25^oС в течение периода от 10 до 36 ч, предпочтительно 24 ч. Реакционную смесь целесообразно забуферить до рН 7-10, предпочтительно до 8,0-9,5. Молярное соотношение между восстанавливающим средством и суммой иминовых и альдегидных групп находится в диапазоне от 1:1 до 5:1, предпочтительно от 1,5: 1 до 3,5: 1, на основании стехиометрии восстанавливающего средства к альдегидным группам, добавляемым для инициирования поперечной сшивки.

Для удаления остаточных продуктов с низкой молекулярной массой, таких как остатки распада крахмала, остатки диметил-аминбора, солей, остатков буфера и т.д., предпочтительно использовать окончательный этап диафильтрации. Затем продукт можно смешивать с подходящим наполнителем для образования НВОС.

Полученный таким образом конъюгат проявляет крайне подходящие свойства для использования в качестве основы НВОС. Он проявляет низкое сродство к кислороду (Р₅₀=20-50 мм рт. ст.) наряду с узким распределением молекулярных масс продукта (РММ 100-200 кДа), при отсутствии выявляемого продукта с молекулярной массой 32 кДа в условиях, которые способствуют диссоциации на αβ-димеры, или с молекулярной массой выше приблизительно 500 кДа.

Для хранения перед использованием целесообразно удалить весь кислород из продукта для предотвращения автоокисления. Дезоксигенированный продукт может храниться в условиях, которые предотвращают внесение кислорода, или в замороженном состоянии, или при более высоких температурах. Кислород может вноситься перед введением или продукту можно дать возможность приобрести кислород in vivo. Монооксидуглеродная форма может храниться аналогичным образом и оксигенироваться перед использованием. Продукт может храниться в замороженном состоянии в оксигенированной форме или при более высоких температурах до тех пор, пока степень автоокисления не будет считаться неприемлемой.

Далее изобретение описывается только в целях иллюстрации в следующих определенных, не ограничивающих примерах.

Пример 1. Получение окисленного гидроксиэтилкрахмала.

9,0 г гидроксиэтилкрахмала со средней молекулярной массой (ММ) 450 кДа, имеющего степень замещения гидроксиэтила 0,7, растворяли в 90 мл воды. 0,49, 0,98 и 1,96 г метапериодата натрия, представляющие собой соответственно около 0,3, 0,6 и 1,2 экв. периодата на 1 моль соседнего диола, присутствующего в HES, добавляли в отдельные аликвоты по 30 мл этого раствора. Этих количеств достаточно для обеспечения приблизительно 30%, 60% и 100% окисления доступных диоловых групп. После 4 ч реакции в темноте при 4^oС растворы подвергали обширному диализу против охлажденной воды с использованием отсекающей мембраны, задерживающей соединения с молекулярной массой от 15 кДа. Конечные задержанные продукты лиофилизировали в порошок белого цвета и хранили при комнатной температуре. Альтернативно раствор подвергнутого диализу окисленного HES может применяться непосредственно для конъюгации Нb. HES с ММ 200 кДа и замещением 0,5 окисляли и готовили аналогичным образом. Окисленный HES также готовили с помощью прямого окисления HES, приготовленного в 0,9% NaCl. Измерения потребления периодата и конечного содержания альдегида показывают, что диапазон использованного периодата привел к окислению, от частичного до полного, всех доступных диоловых групп и что степень окисления легко регулируется с помощью
изменения количества используемого периодата.

Пример 2. Получение конъюгатов с различными окисленными HES и СО-гемоглобином.

Изучали реакцию СО-Нb с различными относительными соотношениями окисленного HES (HES-CHO). На основании ожидаемого содержания соседнего диола в HES рассчитывали эквиваленты периодата для окисления. В одном случае 0,54 г окисленного HES 450 кДа, полученного с использованием 1,2 экв. периодата, как описано в примере 1, растворяли в 3,0 мл 100 мМ буфера HEPES при рН 8,1. Этот раствор HES-CHO добавляли в монооксидуглеродный гемоглобин (СОНb, 200 мг/мл в воде) в следующих соотношениях: 0,76 мл HES-CHO:0,041 мл СОНb, 0,73: 0,078 и 0,61: 0,195, получая конечную концентрацию Нb соответственно около 10, 20 и 50 мг/мл. Реакции проводились при 22-25^oС при рН 8, и образцы удаляли в различное время для определения мМ с использованием колонки Pharmacia Superdex 200 (1 х 30 см), элюированной 0,5 М МgСl₂+25 мМ Tris с рН 7,2 при скорости 0,4 мл/мин. При всех трех соотношениях HES:СОНb Нb полностью модифицировался в течение первых нескольких часов с получением видов, имеющих время элюции, сравнимое с контролями полиНb с ММ более 128 кДа и в диапазоне до превышения предела исключенного объема колонки (полиНb >500 кДа). На фиг. 1 показана хроматограмма, полученная для продукта с соотношением Hb:HES 0,5: 1 (50 мг Hb/мл), взятого в различные периоды времени и в сравнении с контролем полиНb (нижняя кривая). Пунктирная вертикальная линия представляет собой время элюции немодифицированного αβ-димера 32 кДа. В элюируемых фракциях прослеживался спектр поглощения при 414 нм, характерный для гемоглобина. В течение следующих 30 ч время элюции продукта уменьшалось, и были получены виды, имеющие время элюции, сравнимое с контролями полиНb с ММ 128 кДа, для которых не были выявлены ни немодифицированный Нb, ни виды, превосходящие предел колонки. Тип эволюции ММ и диапазоны ММ конечного продукта были аналогичны при всех трех соотношениях HES:Hb, как и при HES, окисленном 0,6 экв. периодата. Конъюгаты, полученные с использованием HES, окисленным 0,3 экв. периодата на диол, обычно содержали значительное количество материала, совместно элюируемого с немодифицированным αβ-димером. Поэтому для генерирования конъюгатов, свободных от немодифицированного димера, предпочтительны более высокие уровни окисления.

Средняя ММ конъюгатов, образованных в течение первых нескольких часов, была ниже при использовании меньшего количества Нb. Аналогичные реакции и результаты были получены при использовании окисленного HES 200 кДа, как описано в примере 1. Средняя ММ конечных продуктов была выше при использовании HES 450 кДа, в сравнении с HES 200 кДа. На фиг.2 показаны хроматограммы конечных продуктов Hb+HES-CHO для HES 200/0,5 (ломаные линии) и HES 450/0,7 (сплошные линии) при различных указанных степенях окисления, все при соотношениях Hb:HES-CHO 1:1.

Конъюгаты Hb-HES, полученные с использованием окисленного периодатом HES 70 кДа (0,3, 0,6 и 1,2 экв. периодата в сравнении с рассчитанным диолом) также образовывали виды с более высокой ММ во время ранней фазы конъюгации с последующей трансформацией в более низкую ММ (фиг.3). Средняя ММ конъюгатов ранней фазы, а также время, требуемое для превращения в виды с более низкой ММ, зависело от степени окисления HES 70. После 48 ч конъюгации некоторое количество материала, совместно элюируемого с немодифицированным компонентом Нb 32 кДа контроля полиОR-Нb, оставалось в конъюгате, полученном из самой низкой степени окисления HES (0,3 экв. периодата на рассчитанный диол). После 48 ч оставалось значительное количество материала, элюируемого на пределе исключенного объема аналитической колонки при реакции с использованием наиболее высоко окисленного HES 70 (1,2 экв. периодата на рассчитанный диол). В пределах 48 ч реакции с HES, окисленным 0,6 экв. периодата на рассчитанный диол, был получен продукт, не содержащий немодифицированный гемоглобин, и материал, элюируемый на пределе исключенного объема колонки.

Пример 3. Одновременное крупномасштабное получение конъюгатов Hb-HES с высокой и низкой ММ.

Два конъюгата Hb-HES с различной ММ получали из единственной реакции, при которой выделяли и стабилизировали часть продукта ранней конъюгации, имеющего высокую ММ, обеспечивая возможность оставшемуся продукту конъюгации перед стабилизацией подвергнуться трансформации в продукт с более низкой MM. Сравнение физических свойств и свойств in vivo двух продуктов проводят так, чтобы можно было продемонстрировать благоприятные свойства одного в сравнении с другим.

944 г HES (200 кДа, степень замещения 0,5) растворяли в 8 л воды для инъекций (ВДИ), охлажденной при 4^oС, затем добавляли 370 г NaIO₄ и смесь перемешивали в темноте в течение 5,3 ч. Весь NaIO₄ растворялся менее чем через 1 ч. Смесь фильтровали (0,2 мкм), затем подвергали диафильтрации против 12 объемов ВДИ при комнатной температуре с использованием мембраны из регенерированной целлюлозы с ММ 30 кДа. Затем ее дезоксигенировали с помощью контакта с N₂ через мембрану из полых волокон. По лиофилизированным образцам определяли, что конечная концентрация составляла 128 мг HES-СНО/мл. 1,2 л СОНb (23,2 г/дл ВДИ) комбинировали с 2,0 л 200 мМ буфера HEPES при рН 8,1, затем оксигенировали и дезоксигенировали путем контакта с O₂, затем N₂ через мембрану из полых волокон. 4,5 кг раствора HES-CHO (128 г/л) комбинировали с дезоксигенированным Нb (3,2 л при 9,0 г/дл) и смесь поддерживали в условиях дезоксигенации. РММ образующихся конъюгатов контролировали методом гель-фильтрации.

После 3 ч конъюгации половину объема реакционной смеси переносили под N₂ в отдельный сосуд и добавляли 56 мл 3М NaOAc и 196 г DMB, растворенных в 1,7 л ВДИ. Конечное соотношение DMB: первоначальный альдегид составляло 1,5:1. Перед загрузкой СО и диафильтрацией смесь держали под N₂ при окружающей температуре в течение 23 ч. Через 29 ч после инициации реакции конъюгации Hb-HES другую половину смеси в течение 17,5 ч аналогичным образом обрабатывали NaOAc и DMB. Затем обе восстановленные DMB реакционные смеси загружали СО и подвергали диафильтрации против ВДИ, а затем лактата Рингера (приблизительно 10 объемов для каждого раствора). С помощью 0,1 н. НСl рН доводили до 7,5-7,6. Оба раствора концентрировали так, чтобы коллоидно-осмотическсе давление было 80-100 мм рт. ст. Продукты оксигенировали и приблизительно три четверти удаляли для стерильной фильтрации и упаковки в оксигенированной форме. Оставшиеся количества каждой половины дезоксигенировали и упаковывали в дезоксигенированной форме. Оксигенированные продукты хранили при -80^oС, дезоксигенированные продукты - при 4^oС. Продукт с более высокой ММ, полученный с помощью восстановления продукта ранней стадии конъюгации, далее именуется здесь HIMW HES-Hb. Продукт с более низкой ММ, полученный с помощью восстановления продукта поздней стадии конъюгации, далее именуется здесь HIMW HES-Hb. Распределение ММ, оцененное с помощью гель-фильтрации, показано на фиг.4. В течение 4 месяцев хранения либо при 4, либо при -80^oС распределение ММ не менялось.

Коллоидно-осмотическое давление (КОД) HIMW HES-Hb при различных исследованных концентрациях было стойко выше, чем LOMW HES-Hb для обоих продуктов (см. таблицу в конце описания). Вязкость при содержании гемоглобина 6,5 и 9,0 г Нb/дл составила для HIMW HES-Hb и LOMW HES-Hb соответственно 8,9 и 3,0 сСт. Поэтому HIMW HES-Hb, который сравним по распределению ММ с конъюгатами HES-Hb и декстрана-Нb, полученными другими авторами, имел коллоидные свойства, которые, как следовало бы ожидать, могли привести к большему изменению жидкостных и реологических свойств крови, чем LOMW HES-Hb. Были описаны неблагоприятные воздействия компонентов плазмы, содержащих HES с более высокой ММ, на реологические факторы, такие как вязкость и агрегация эритроцитов, и на свертывание крови (Treib et al. Thrombosis and Haemostasis 74: 1452-6 (1995)).

Пример 4. Влияние лигандного состояния на конечное P₅₀.

СОНb (55 мг/мл в воде) оксигенировали и дезоксигенировали соответственно с помощью контакта с кислородом, а затем азотом. HES 200 кДа оксигенировали с использованием 0,6 экв. периодата, как описано в примере 1, доводили до концентрации 60 мг/мл в 100 мМ HEPES при рН 8,1, дегазировали и продували азотом. 2,5 мл этого окисленного раствора HES добавляли в 0,8 мл дезоксигенированного раствора Нb, обеспечивая 1 экв. Нb на 1 моль первоначального неокисленного HES 200 кДа. После 48 ч при 22-25^oС под азотом реакционную смесь доводили до 0,3 М в ацетате натрия, затем добавляли 3 экв. диметиламинбора на 1 моль первоначального альдегида. После 24 ч раствор загружали газообразным СО и подвергали полному диализу против раствора лактата Рингера. Проводили аналогичную процедуру, при которой СОНb без удаления лиганда СО вступает в реакцию с HES 200 кДа, окисленным 0,6 экв. периодата. Свойства связывания кислорода измеряли для обоих продуктов с использованием Hemox-Analyzer (TCS Instruments, Southhampton, Pennsylvania, U.S.A.) при 37^oС. Конъюгация дезоксигенированного Нb приводила к конечному Р₅₀ 26 мм рт. ст. Конъюгация СОНb приводила к конечному Р₅₀ 4 мм рт. ст. Оба продукта проявляли свойство некооперативности.

Пример 5. Применение поперечно сшитого гемоглобина.

HES 200 кДа оксигенировали с помощью 0,3 экв. и 0,6 экв. периодата в отдельных реакциях, как описано в примере 1, и доводили до концентрации 125 мг/мл в 270 мМ бикарбонате натрия при рН 8,1. 3,0 мл каждого оксигенированного раствора HES добавляли в отдельные аликвоты по 1,0 мл тримезоил-трис-(метилфосфата) (ТММР)-поперечно сшитого Нb (поперечно сшитый Нb 64 кДа, патент США 5250665, выданный Kluger et al., 125 мг/мл в воде) и аналогичным образом - в аликвоты по 1,0 мл Нb, полимеризованного о-раффинозой (полимеры Нb от 64 до <500 кДа, патент США 5532352, выданный Pliura et ai., 117 мг/л) всего для 4 реакций, обеспечивая во всех случаях 1 экв. Hb на 1 моль первоначального неокисленного HES 200 кДа. Оба продукта гемоглобина представлены в СО-форме. После 30 ч реакции при 22-25^oС под газообразным СО добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М. Затем добавляли 3 экв. диметиламинобора на 1 моль первоначального альдегида. После 24 ч реакционные смеси подвергали диализу (MWCO) против воды, а затем раствора лактата Рингера при рН 7,4. Свойства связывания кислорода регистрировали с использованием Неmох-Analyzer при 37^oС.

Распределение ММ всех форм Hb было сдвинуто в сторону более высоких величин. С помощью Hb и Hb, поперечно сшитого ТММР, можно было модифицировать весь исходный Hb, и в пределах 48 ч не выявляли материала с объемом пустот (Супероза 12, диссоциирующие условия). Конъюгаты полиОR-Нb содержат значительное количество материала с объемом пустот. P₅₀ (37^oС) составили: HES+СО-ТМ-Нb 5-7 мм рт. ст.; HES+СО-полиОR-Нb 5-7 мм рт. ст. Оба продукта проявляли свойство некооперативности.

Пример 6. Изменение времени и температуры реакции.

Влияние более короткого времени реакции и более низкой температуры (12 в сравнении с 22^oС) на распределение MM Нb-HES изучали в небольшом масштабе. Использовали окисленные формы HES 200 и 450 кДа.

Использовали дезоксигенированный Hb. СОНb (50 мг/мл в 75 мМ буфере HEPES с рН 8,1) оксигенировали и дезоксигенировали с помощью воздействия соответственно кислородом, затем азотом. Оксигенированный HES, полученный из HES 200 или 450 кДа с использованием соответственно 0,6 или 1,2 экв. периодата на 1 моль соседнего диола, растворяли в 100 мМ буфере HEPES с рН 8,1 до конечной концентрации 60 мг/мл и растворы затем дегазировали и продували азотом. 0,253 мл Нb комбинировали с 1,6 мл окисленного раствора HES 200 кДа и 0,498 мл Нb комбинировали с 1,4 мл окисленного раствора HES 450 кДа, в обоих случаях обеспечивая 1 экв. Нb на 1 моль первоначального неокисленного HES 200 или 450 кДа. Этим растворам давали возможность вступить в реакцию при 22^oС под азотом, готовили идентичные растворы и давали им возможность вступить в реакцию при 12^oС. Распределение ММ определяли в различных временных точках, как описано в примере 2. Хроматографические профили показаны на фиг.5.

Конечное распределение ММ было более узким при 22^oС для обоих окисленных HES и при более длительном времени реакции для обоих температурных режимов. Средняя ММ продукта HES 450 кДа (сплошные линии) была больше, чем для производного 200 кДа (пунктирные линии), причем разница ММ была большей при более низкой температуре. Реакции протекали медленнее при более низкой температуре, приводя к большей средней ММ и к более широкому диапазону молекулярных масс, в сравнении с аналогичным временем реакции при более высокой температуре.

Пример 7. Усиление конъюгации.

Конъюгация окисленного HES с диоксиНb была усилена для оценки in vivo.

Концентрацию СОНb в буфере 100 мМ HEPES при рН 8,1 доводили до 125 мг/мл и освобождали от лиганда с помощью контакта с кислородом, а затем с азотом при использовании газообменника с полыми волокнами. 47 г окисленного HES 200 кДа, полученного, как в примере 1, с использованием 0,6 экв. периодата, растворяли в 280 мл буфере 100 мМ HEPES при рН 8,1, затем дегазировали и продували азотом. Затем раствор окисленного HES добавляли в диоксиНb и поддерживали под азотом при 22-25^oС с периодическим измерением распределения ММ. В пределах 16 ч весь Нb модифицировался, и при предельном исключенном объеме колонки продукт не элюировался (фиг.6). Самая нижняя кривая, представленная в целях сравнения, получена от Нb, поперечно сшитого с раффинозой с кольцом, раскрытым при окислении (полиОR-Нb). Реакцию проводили при концентрации основного реагента 0,4 М в ацетате натрия и добавляли 36 г диметиламинбора, представляющих приблизительно 3 экв. бора на 1 моль первоначального альдегида. Через 21 ч реакционную смесь оксигенировали, диафильтровали (СО с ММ 10 кДа) против раствора лактата Рингера и рН доводили до 7,4. Продукт имел P₅₀ (37^oС) 26 мм рт. ст. и проявлял свойство некооперативности. Анализ рассеивания низкоугольного лазерного излучения вытекающего после гель-фильтрации раствора указывал на ММ от 90 до 210 кДа. Свободный альдегид не выявлялся.

Анализ периода полужизни in vivo показал, что продукт Hb-HES удерживается в течение продолжительных периодов времени. Объем продукта в концентрации, доведенной до 3,0 г/дл в растворе лактата Рингера, эквивалентный 10% общего объема крови, вливали бодрствующим крысам и определяли время удерживания в сосудистой системе. Период полужизни составлял 6,0 ч в сравнении с 5,1 ч, определенным для эквивалентного объема полиОR-Нb с концентрацией 10,0 г/дл в растворе лактата Рингера.

Пример 8. Конъюгация Нb с окисленным декстраном и трансформация в область более низких ММ.

Два окисленных декстрана получают с использованием либо 0,45, либо 1,36 экв. периодата на диол (2 диола на мономер цепи декстрана). Растворы 2,0 г декстрана (260 кДа) растворяли в 40 мл воды при 4^oС, обработанной либо 2,39, либо 7,18 г периодата натрия (соответственно 0,45 и 1,36 экв.). После 4 ч перемешивания в темноте при 4^oС раствор подвергали диализу (отсечение ММ 10 кДа) и лиофилизировали в порошок белого цвета. 50 мг окисленного декстрана в 1 мл буфера 80 мМ HEPES с рН 8,1 комбинировали с 0,062 мл СОНb (200 мг/мл) и реакцию конъюгации контролировали методом гель-фильтрации в диссоциирующих, неденатурирующих условиях (0,5 М MgCl₂+25 мМ Tris с рН 7,4). Результаты показаны на фиг.7 для продукта, в котором декстран окислялся с использованием 0,45 экв. периодата на диол, а на фиг.8 - для 1,36 экв. периодата на диоловый эксперимент. Обе реакции показали первоначальное образование видов с высокой ММ, элюируемых в основном в исключенном объеме колонки. Конъюгат, полученный из высоко окисленного декстрана, быстрее трансформировался в виды с низкой ММ, чем при использовании менее окисленного декстрана. Подобие профилей ММ контроля полиОR-Нb и высоко окисленного конъюгата декстрана, за исключением в целом более высокой ММ последнего, свидетельствует о том, что конъюгат составлен из полимеризованных, поперечно сшитых видов Нb, которые декорированы полисахаридными фрагментами. Эта конфигурация предполагается также для окисленных конъюгатов HES, полученных в таких же условиях (фиг.3).

Пример 9. Период полужизни конъюгатов Hb-HES с низкой и высокой ММ.

Самцов крыс линии Sprague Dawley выдерживали для адаптации в течение недели при свободном доступе к пище и водопроводной воде. В день эксперимента крыс наркотизировали препаратами Ketaset (кетамина гидрохлорид, 60 мг/кг, внутримышечно) и Atravet (ацепромазина малеат, 2,0 мг/кг, внутримышечно). В правую бедренную артерию и вену вводили канюли с помощью трубки из полиэтилена марки РЕ10 длиной 2,5-3,5 см, соединенной с трубкой из полиэтилена марки РЕ50, заполненной солевым раствором с гепарином (50 единиц гепарина по Фармакопее США/мл). Трубку из полиэтилена марки РЕ10 длиной 2,0-3,5 см вводили в нижний отдел брюшной аорты через бедренную артерию и в полую вену через бедренную вену. Обе канюли помещали в подкожный туннель и выводили наружу в области затылка. В конце операции операционную рану зашивали хирургической нитью. В конце процедуры обе канюли заполняли солевым раствором с гепарином (500 единиц гепарина по Фармакопее США/мл). Затем животных помещали в устройство для фиксации грызунов с миниатюрными шарнирными устройствами для подачи корма и помещали отдельно в метаболические клетки. Животным давали возможность в течение 0,5-1,5 ч восстановиться после операции, и они находились в метаболической клетке в течение всего эксперимента. После периода восстановления венозную канюлю соединяли с автоматическим инфузионным насосом. Бодрствующих животных подвергали вливанию контрольных растворов (10 г/дл полиOR-Нb в растворе лактата Рингера, и этот же раствор, разведенный до концентрации 4 г/дл в плазме) или исследуемых изделий (продукты примера 2 HES-Hb с низкой молекулярной массой (НММ) и высокой молекулярной массой (ВММ) соответственно в концентрации 5,0 и 3,5 г Нb/дл в растворе лактата Рингера), что эквивалентно 10% общего объема крови, при скорости подачи 0,2 мл/мин. Образцы крови брали через 20 мин после окончания вливания (время 0,33 ч после вливания) и затем через 1, 3, 6, 10, 22, 28 и 34 ч. Плазму отделяли путем центрифугирования и хранили при -80^oС до анализа методом гель-фильтрации. Общее содержание гемоглобина рассчитывали по спектру поглощения при 414 нм, с поправкой на фон и наносили на график зависимости от времени взятия крови, периоды полужизни в плазме получали на основании одиночных экспоненциальных аппроксимаций. Периоды полужизни в плазме составляли 5,1, 5,5, 8,9 и 15,6 ч для 4 и 10 г/дл полиOR-Нb и растворов HES-Hb соответственно с НММ и ВММ.

При сравнении с периодом полужизни, полученным для продукта примера 7, который имел распределение молекулярных масс, аналогичное распределению НММ, по ограниченным экспериментальным данным оказывается, что более длинный период полужизни получен для последнего из указанных продуктов, который получен из более высоко оксигенированного HES.

Пример 10. Устойчивость Hb-HES в плазме in vitro.

Hb-HES, полученный в примере 6, разводили в 10 раз в плазме крыс и инкубировали при 37^oС, имитируя введение избыточного количества, составляющего 5-10% (об. /об.). Смесь анализировали методом гель-фильтрации в диссоциирующих, неденатурирующих условиях (0,5 М MgCl₂+25 мМ Tris с рН 7,4) в течение 49 ч. Результаты показаны на фиг.9. В это время не выявлялись виды с низкой молекулярной массой, свидетельствующие о распаде продукта. Виды с высокой молекулярной массой, элюируемые при предельном исключенном объеме аналитической колонки, появлялись в пределах первого часа инкубации. Эти виды соответствуют комплексам модифицированных гемоглобинов с высокой молекулярной массой и крысиного гаптоглобина, что согласуется с наблюдениями, сделанными при использовании нескольких других продуктов полимеризованного гемоглобина, инкубированных в плазме.

Пример 11. Стабилизация видов с различной ММ в процессе конъюгации Hb-HES.

Для завершения изменений молекулярной массы, происходящих во время конъюгации Нb с окисленным HES, использовали восстановление диметиламинбора (DMB). Дезоксигенировали 2,0 мл СОНb (200 мг/мл в Н₂О), комбинированного с 490 мкл 80 мМ HEPES с рН 8,1. 674 мг загруженного N₂ окисленного HES (полученного ранее из HES 450/0,7, 1,10 экв. периодата на рассчитанный диол) растворяли в 6,8 мл дегазированного 80 мМ HEPES с рН 8,1. 950 мкл раствора Нb добавляли в окисленный раствор HES, получая конечное соотношение Hb:HES (450 кДа) 1:1. Через 3 ч 2 мл этой реакционной смеси добавляли в свежеприготовленный раствор 152 мг загруженного N₂ DMB (обеспечивая приблизительно 3 экв. DMB на первоначальный альдегид, рассчитанный для окисленного HES), растворенный в 1,6 мл дегазированной воды в 350 мкл с добавленным 4 М NaOAc. Аликвоты по 2 мл реакционной смеси Hb-HES аналогичным образом обрабатывали через 6 ч. Через 22 ч реакционные смеси загружали СО и подвергали обширному диализу против воды в течение 72 ч при 4^oС. Распределение ММ во время конъюгации, восстановления и после диализа определяли методом гель-фильтрации в диссоциирующих, неденатурирующих условиях (0,5 М MgCl₂+25 мМ Tris с рН 7,4). Результаты показаны на фиг. 10 для продуктов, подвергнутых восстановлению через 3 ч, на фиг.11 - для продуктов, подвергнутых восстановлению через 6 ч, и на фиг.12 - для невосстановленных продуктов. Распределение ММ продуктов, наблюдаемое через 3 и 6 ч (оба конъюгата с высокой ММ), значимо не меняется ни в течение 22 ч восстановления при комнатной температуре, ни в течение 72 ч диализа при 4^oС. Поэтому, как видно в образцах, которые не были восстановлены (фиг.10), восстановление 3 экв. DMB на первоначальный альдегид предотвращало трансформацию конъюгата Hb-HES в таковой с более низкой ММ. Как описано в примере 3, стабилизация видов с высокой ММ наблюдается также при использовании меньшего числа эквивалентов DMB на первоначальный альдегид. Этот способ восстановления можно использовать для стабилизации любого распределения ММ, которое развивается во время реакции конъюгации.

Изобретение относится к биологически совместимым переносчикам кислорода для введения пациентам в качестве добавки или частичного замещения цельной крови. Конъюгаты гемоглобина, которые могут использоваться в качестве переносчиков кислорода на основе гемоглобина, получают с помощью обеспечения реакции гемоглобина с полисахаридами с открытым при окислении кольцом, такими как гидроксиэтилкрахмал или декстран, и хранения полученного в результате конъюгата в условиях, которые позволяют ему после конъюгации трансформироваться в продукт с более низкой молекулярной массой. Затем конъюгат подвергается восстановительной стабилизации для образования вторичных аминосвязей между гемоглобином и полисахаридом и составляется в композицию в качестве переносчика кислорода на основе гемоглобина. Технический результат: способ обеспечивает получение нового конъюгата полисахарид-гемоглобина. 2 с. и 43 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл.

1. Способ получения композиции восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид, подразумевающий провести следующие этапы: (а) подвергнуть исходный полисахарид реакции открытия кольца при окислении с получением полисахарида с оксидативно открытым кольцом, несущего альдегидные группы; (б) обеспечить реакцию указанного полисахарида с оксидативно открытым кольцом с гемоглобином в условиях, подходящих для образования связей основания Шиффа между гемоглобином и полисахаридом с оксидативно открытым кольцом, с образованием композиции исходного конъюгата гемоглобин-полисахарид, содержащей окисленные полисахариды; (в) подвергнуть деградации полисахарид с оксидативно открытым кольцом путем поддержания композиции конъюгата в регулируемых условиях водного раствора с заданным рН до тех пор, пока не будет достигнуто необходимое снижение средней молекулярной массы композиции гемоглобин-полисахарид по сравнению с исходной композицией гемоглобин-полисахарид, с образованием выявляемой композиции дальнейшего деградированного конъюгата гемоглобин-полисахарид со сниженной средней молекулярной массой и сниженным количеством непрореагировавшего гемоглобина по сравнению с композицией исходного конъюгата гемоглобин-полисахарид; (г) обеспечить восстановление указанной композиции дальнейшего деградированного конъюгата гемоглобин-полисахарид, когда будет достигнуто необходимое снижение средней молекулярной массы композиции гемоглобин-полисахарид по сравнению с исходной композицией гемоглобин-полисахарид, с получением композиции восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид; (д) извлечение указанной композиции восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид.2. Способ по п.1, где выявляемая композиция дальнейшего деградированного конъюгата гемоглобин-полисахарид со сниженной средней молекулярной массой и сниженным количеством непрореагировавшего гемоглобина имеет также более узкое распределение молекулярных масс по сравнению с указанной композицией исходного конъюгата гемоглобин-полисахарид.3. Способ по п.1, где в указанной композиции восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид нет выявляемого немодифицированного гемоглобина и нет конъюгата с кажущейся молекулярной массой примерно свыше 500 кДа.4. Способ по п.1, где на стадии (а) окислено от 30 до 100% доступных диоловых групп на полисахариде с оксидативно открытым кольцом.5. Способ по п.4, где окислено от 60 до 100% доступных диоловых групп на полисахариде с оксидативно открытым кольцом.6. Способ по п.5, где окислено 100% доступных диоловых групп на полисахариде с оксидативно открытым кольцом.7. Способ по любому из пп.1-6, где исходный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 до 1000 кДа.8. Способ по п.7, где исходный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 до 450 кДа.9. Способ по п.8, где исходный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 до 260 кДа.10. Способ по п.9, где исходный полисахарид имеет молекулярную массу 70 кДа.11. Способ по любому из пп.1-10, где исходный полисахарид представляет собой декстран или гидроксиэтилкрахмал.12. Способ по п.11, где исходный полисахарид представляет собой гидроксиэтилкрахмал.13. Способ по п.12, где гидроксиэтилкрахмал имеет соотношение замещения приблизительно от 0,5 до 0,7.14. Способ по любому из пп.1-13, где соотношение масс гемоглобина и окисленного полисахарида композиции восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид составляет от 0,25:1 до 5:1.15. Способ по п.14, где соотношение масс гемоглобина и окисленного полисахарида составляет от 0,5:1 до 3:1.16. Способ по любому из пп.1-15, где исходный конъюгат поддерживается на стадии (в) в водном растворе при рН примерно от 7,2 до 10 и при температуре от 15 до 30°С для снижения средней молекулярной массы исходной композиции конъюгата.17. Способ по п.16, где исходный конъюгат поддерживается в водном растворе в течение 4-48 ч.18. Способ по любому из пп.1-17, где кажущаяся молекулярная масса восстановленных конъюгатов в результирующей композиции преимущественно составляет примерно от 90 до 200 кДа.19. Способ по любому из пп.1-18, где указанная стадия восстановления (г) представляет собой единственный этап восстановления для достижения восстановления указанных оснований Шиффа и, по существу, одновременного восстановления альдегидных групп.20. Способ по п.19, где восстановление достигается с помощью восстанавливающего средства на основе бора.21. Способ по п.20, где восстанавливающее средство на основе бора представляет собой диметиламинбор.22. Способ по любому из пп.1-18, где указанная стадия восстановления (г) проводится в два последовательных этапа восстановления, первый - для достижения восстановления оснований Шиффа, а второй - для восстановления альдегидных групп.23. Способ по любому из пп.1-22, где гемоглобин является гемоглобином млекопитающего.24. Способ по п.23, где гемоглобин является не-человеческим гемоглобином.25. Способ по п.23, где гемоглобин является гемоглобином человека.26. Способ по любому из пп.23-25, где гемоглобин является дезоксигемоглобином.27. Способ по любому из пп.23-25, где гемоглобин является карбоксигемоглобином.28. Способ по любому из пп.23-27, где гемоглобин является внутримолекулярно и/или межмолекулярно поперечно сшитым.29. Способ по любому из пп.1-28, где композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид имеет показатель Р₅₀ от 4 до 50 при 37°С.30. Способ по любому из пп.1-28, где композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид имеет показатель Р₅₀, заключенный между R- и Т-состояниями гемоглобина.31. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид, полученная способом по любому из пп.1-30.32. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид, полученная способом по п.1.33. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид, полученная способом по п.6 или 12.34. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид, включающая в себя деградируемый щелочью полисахарид с открытым при окислении кольцом.35. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.34, полученная с использованием гидроксиэтилкрахмала или декстрана в качестве полисахарида.36. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.35, где полисахарид представляет собой гидроксиэтилкрахмал.37. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.36, где гемоглобин является гемоглобином млекопитающего.38. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.37, где гемоглобин является гемоглобином человека.39. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.37, где гемоглобин является дезоксигемоглобином.40. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.37, где гемоглобин является карбоксигемоглобином.41. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по любому из пп.37-40, где гемоглобин является внутримолекулярно и/или межмолекулярно поперечно сшитым.42. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по любому из пп.37-41, где полисахарид представляет собой гидроксиэтилкрахмал с молекулярной массой примерно от 70 до 1000 кДа.43. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по п.42, где гидроксиэтилкрахмал имеет соотношение замещения приблизительно от 0,5 до 0,7.44. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по любому из пп.34-41, имеющая Р₅₀ от 4 до 50 при 37°С.45. Композиция восстановленного конъюгата гемоглобин-полисахарид по любому из пп.34-41, имеющая показатель Р₅₀, заключенный между R- и Т-состояниями гемоглобина.