Способ получения плазмозаменителяраствора гемоглобина Советский патент 1978 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к .медицине кой промы.иленности.

Способ получения плазмозамеыителя раствора гемоглобина в патентной литературе не описан.

Целью изобретения является получение препарата, способствующего регулированию кровяного давления и препятствующего возникновению отека

Это достигается тем, что раствор гемоглобина обрабатывают при рН от 7,4 до 8,5 сшивающим агентом из групы диалкиловых эфиров дииминокарбоновых кислот с числом метиленовых групп от 1 до 12, например дизтилдииминомалонатом, и образовавшийся целевой продукт с мол.в. от 680СО до 600000 отделяют от низкомолекулярных продуктов преципитацией.

Способ осу1цеств.пяют следующим образом ,

Первоначально гемоглобин получают из красных кровяных клеток путем промывания красных клеток и выделением всех мембран центрифугированием с высокой скоростью, Получаюы.ийся димер или тетрамер гемоглобина затем взаимодействуют при температуре от -5 до с сшивающим агентом пр;: ззсЯ е:иях рИ 7,4-6,5 при наттрерывиог: ::.. тpиэтилa 1Иfia .

По.иучак-: : рэдукт, состоящий из нокстосогс -.О ,-ичестаа (епрореагиро1 лзшего ге1-,ч. , с мол. в . tUJiiie бЭСОСО и ж a ;oj :i65ii;.a, иг.юющего мол.в 5SOCO-&OCOCOЛосле этого полученный продукт сс, i.naraT ns ej-i добавления сульфата до насшдекия 0,2-0,25%, в оег, .;ь-гате -;src ocasoiasTCH высокоi г:.:;:гг лярный прол:/1 т с мол . в . 600000 Пг-сле центрифугирозання осадка в частично очищенный реакционный проп 47 .1юбав.п.:ют сульфат амлюния до JC% ::асы;дени я,- получают сшитый гемоглобин с мол.з. 68000-600000.

Оса.жданный прол,укт сульфат аммон:-;я - сшитый гелюглобин подвергают .анализу для удалечия сульфата аммония из СИ.1ИТОГО гемоглобина в соотвптствующем солбйог ; растворе, остается сшитый ге.моглоб.н с мо.п . в , 68000600000

Вах;нуга роль s направлении процесса к Б определе;-:ии получающихся продуктов играет конЕШНтрация гемоглобина в pacTEOpe, в котором i-iaxoдится сшиваю;л1;-;й агент. 62985 П Р и м ер 1, В реактор с магнитной мешалкой, охлажде 1нь,й до 5 С загружают 2,4 г лиэтилдиимкномаг1аь:ата гидрохперила, растворенного в 5 мл 0,5 М буферного фосфата натрия, рИ 8,5, Затем гто каплям добавляю 5М раствор Па ОН до тех пор, пока реакционный раствор не станет .) ного цвета (рН 7-8), после чего быстро добавляют 50 лол 10%-Е-:ого растзог а гемоглобина; рН доводят до 8 .. 5 добавлекием щелочи и поддерживают i-;a таком уровне по мере протекания ре- К акции, через 1,5-2 час реакция завершается, что обнаруживают по прекращению вьщеления кислоты. Полигемоглобин отделяют от ниэкомодекуллррюго материала осаждением jr сульфатом аммония, доводя содержа ние его до 0,5 и затем отделяют цектрифугирование.м. Осадок снова р астворяют в воде и снова дважды переосаждают сульфатом а;ло;:ия. Получсии-;й; ,,, осадок раствогглэт з зоде ло пслуч;-:ния 10%-ного раствора и Т1о, диализу относит ель ко 3 i О миллисс )оляр ;ого раствора фосфата натрия;рН 7,4, фильтрупт чере: ; -оильтр о диаметром пер 0,25 мк-,; и хранят тэн т емп р р а т у р с; 5 Г . Выход в трех опытах сос а;:1- л 40j44 и 47% от исходного мат8р;-:с:. и зависит от коииентраиии рас vni-ja гемоглобина - Пример 2. Реакцию и кыле-ленке продукта ocy:aeciB;i.;-j по ,-::меру i за иoключcн e i того, г.го -,;ес то 0;05 М буферного растяора ;0;i::-r-та натрия, рН 8,5 и 5 iV pncvj ..i- : КаОН используют тр}- эти; ам::м д/;:уменьшения степени денатурзцн: Гс моглобина при добачленни 1ябь;т; й сильной щ.елочи , Быход составил Еьпие 55-60%, ; ; полученный по примерам I : , с /лтаржит небольшое коли-гество ,и;: .; мол . в . 8 О О О О О ( кот ора я с ncjc о б с г н ,:; т обр)азованию нерастворимого матгр:-;а;;а .. Его выделяют предаарительньцл ос.;хчс-кисм сульфато аммония ло сог.:-,2о;:;а- -5 ния 0,20-0; 25, Этот- осадок о бол--:вают и остая111ийся полиге :ог:1о5;-:осаждают путем уве..:-;чсн;;я г;омц; ; -:;;-.-ции сульфата г мон;;я до 0,50. Пс.:.---ченный раствор стабилен з затвор ::,:; .} ног-1 состоянии, Полигемоглобйг как пла з:- О5а;Si: : тель луч1- с поирод}1ого гемог-лобк- з, так как сам гемоглобин при вл;-; , г:и. в плазму имеет ограниченное зое; ,.. жкэнеспоообност, Гемоглоо;; : :::;:;: диссоциировать на димерч:. о/ор е в заикодействуот с кор:-.:г.пьн;11 /- rsnvorлобэтном плазмы с o6i;a3o; aHMeM ко.1П-лекса, котооый вьщеляетсй оетикуло ,- --60 Сп Ез ;н ;а Оы е i ;-i I:--, С лг :10л де пл коо :.:a зу ку до ,5;, ;; О::., Л;.0 :. HOj :--з ::- т ;-( ::-. ;irrg ;;o4Kai.iH, По;;;1меры гемоглобина nf нмодейс куют с геггтогдобином П-ПЛЗ к ie дессоцн 1ГУ:от полностью на оль:м;5л Фрагменты, ьоторые могут ь .леиь почками. (;:равпэние вролзе-п; дейстяия в плаз-нормального гег оглоб :;;а и поли ::;MO:ie fулярг-ого о ШГ;ого) гемогдобибыло проза,цено на кроликах. Перзоча-:;;.рьно на этих кроликах акавливают время действия кро.ого гемоглобина норгиаль югo и игел Оглобин а, Затем ка них опреяют продол ительнооть действия в зме человеческого гемоглобина .1а.11ьного и полигемогдобина, Поли;-:i-i : гемоглобин, который исполь- предота;5ДЯ2Т ообоп смесь модо, ;,;-.;ек: л::х на 85% мол; , в . от 300000 450000, В реакции ошивания участт ;: оредие;. 27 дггзильных амино::.: в тогог.мере (пз обцего числа , - 3 ; : К . СО riJi .. . -. 4;j/;O:.. ..С ко;-- :/о Оглоби; а ;-.::pOi K;: ; з.-;з;:: -/р:-; те;:;и ратуре -пью р-;--:: :ь г. з;и;; д,обапл , ч ; ; f ;:.:-с;,:. о;г-.,;и; ди зтмлдшт: ,3 л- -огнием т ри;-т;- лам1 -:- п:- --:-;.з:::г , Чороз 1-2 г. Pti ;v о pViVK- ni добавлять : . .: . , о,-;.ср,, рН . ; .-i;.:p; -.:т:.. , ; J добав. :з;--;::.:,v со.::;о|1Л 1 хнс.-Огх i: цент-г;рЗ; : Л- :-; -.Ч ;, К-: )созо зорн- --.i .30;o:rF.:-p;-:ui: до -;: . -: :iio:rj |:лцп ч гемогло.; ::о: о, ж попворга . .,ьно О ; 9 ь -ноге; : ГеакцПО и MoTO/ui. : - о примеру 4.- псполь. ciOiiOS .чеТ Л;;иИ Оовторикт реп);i;:;r.- ,.; Л-лОи;1 4. ; СПОЛЬЗУЯ .-,: i; ::;с диметилового ;;: гр; ч;со2сл1 кислоты на :..: - К:-: о рас:рора Ic.-: :; . повторяют .:ч; : л;л.;орл 4, испг;льзуя .:;; ;;::;;;: д:,М .:ст и:ли;ими но;;г :oo--:ii- c 100 l%-Horo , -ircGj:; определить сте;-OL: -: ;- :/Jpiif H OirJiiBKr, ОПр :;;i ;.-;. -.i.iO ;-.3;v:er: ул 41. iiijo j з.мз-гС Гог-юглобина , ::., п -i-epaf-i, путем - --;::- :;о-:; --;г огрнфичссОс:г. :; 6ь- or градуир1 --- ;- i Л}7 О;лньП ;

створ гемоглобина и добавляют отдельными порциями; получают продукт,- В5 90% которого имеет мол„я. 68000,

Получают внутримолекулярно 1:п11ить;й тетрамер гемоглобина, который не должен диссоциировать на фрагменты более низкого молекулярного веса. Была измерена степеь ь воэмох коД диссоциации путем взанмодействия каждо го модифицированного гемоглобина с додецилсульфатом натрия при электрофорезе на геле полиакриламида,

После окрашивания каждой белковой зоны и обесцвечивания определяют относительное распределение диссоциируемых единиц с помощью сканирушшего денситометра и проводят сравнение с белками с известными молекулярными весами Фоагментов.

Предлагаегчый c ioco6 позволяет получить плаэмозаменитель раствора гемоглобина, который поддерживает уровень кровяного давления до заранее определенного значения и препятствует возникновении отека.

-Способ получения плазмозаменителя -- ра7твог а гемоглобина, о т л и ч а ю |д и и с я тем,- что раствсэр гемоглобина обрабатывают при pif от 7f4 до 8,5 сшиваюшмм агентом из Группьз диалкчловых эфиров дииминокарбоновых кислот с числом метиленовых групп от 1 до 12,- например, диэтилдии мин ома лона том и образовавитийся целевой продукт с мол.в, от 68000 до 600000 отделяют от низко.молекулирных продуктов преципитацией,