КОНЪЮГАТ ГИДРОКСИАЛКИЛКРАХМАЛА И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЕЩЕСТВА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК C08B31/12 C08B31/18 A61K47/48 A61K47/36 

Множество низкомолекулярных веществ представляет коммерческий интерес, в особенности лекарственные биологически активные вещества и средства защиты растений, использование которых ограничивается или даже становится невозможным из-за неудовлетворительных свойств растворимости в водной среде и/или незначительного времени пребывания в организме. Так, например, маленькие молекулы лекарственных средств вследствие гломерулярной фильтрации в почке (предел выведения примерно 70 кДа) часто слишком быстро снова выводятся из системы кровообращения, так что необходимо постоянное дорогостоящее и неприятное для пациента дополнительное обеспечение этим лекарственным средством, например, за счет часто повторных введений или инфузии.

Для избежания этого недостатка в некоторых случаях труднорастворимые лекарственные биологически активные вещества вводят в виде масляного болюса, который в месте инъекции часто образует болезненные отложения. Сверх того, использование таких труднорастворимых лекарственных средств часто связано с токсическими побочными действиями из-за их отложения в таких органах, как печень и/или почка. Следствием таких нежелательных побочных действий является то, что сильно ограничивается используемый in vivo диапазон концентраций биологически активного вещества.

Наблюдаемый в недавнее время подход к преодолению описанных проблем состоит в связывании таких проблематичных веществ с хорошо растворимыми биосовместимыми полимерами, как, например, полиэтиленгликоль и декстран. За счет связывания, с одной стороны, можно повышать молекулярную массу выше порогового значения 70 кДа, так что можно заметно увеличивать время пребывания в плазме более маленьких молекул, с другой стороны, за счет гидрофильной полимерной части можно повышать растворимость в водной среде.

До сих пор многочисленные модификации осуществляются с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) или декстрана, причем, в основном, предпочтителен ПЭГ, так как он дает более простые продукты. Декстрановые конъюгаты, однако, часто проявляют высокую аллергенность, незначительную метаболическую стабильность и во многих случаях имеют незначительный выход при реакциях связывания. В случае использования ПЭГ-конъюгатов также сообщается о побочных действиях, от неприятных до опасных, как зуд, реакции повышенной чувствительности и панкреатит. Далее, часто биологическая активность биологически активных веществ после связывания с ПЭГ частично сильно снижается. К тому же еще в значительной степени неизвестен метаболизм продуктов разложения ПЭГ-конъюгатов и возможно представляет собой угрозу здоровью.

Таким образом, по-прежнему существует потребность в физиологически приемлемых альтернативах в отношении декстрановых или ПЭГ-конъюгатов, с помощью которых можно повышать растворимость плохо растворимых низкомолекулярных веществ и/или увеличивать продолжительность пребывания низкомолекулярных веществ в плазме, благодаря чему достигают улучшенных фармакодинамических свойств активной молекулы.

Задачей изобретения поэтому является получение таких альтернатив и разработка простых и эффективных способов получения таких альтернативных конъюгатов.

Неожиданно было показано, что поставленная задача может быть решена с помощью конъюгатов гидроксиалкилкрахмала, которые отличаются тем, что связывающее взаимодействие между молекулой гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярным веществом основано на ковалентной связи, которая образуется в результате реакции связывания между концевой альдегидной группой или образующейся из этой альдегидной группы за счет химического превращения функциональной группой молекулы гидроксиалкилкрахмала и функциональной группой низкомолекулярного вещества, реакционноспособной по отношению к этой альдегидной группе или образующейся из нее функциональной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, при этом связь, образующаяся непосредственно при реакции связывания, в случае необходимости, может быть модифицирована за счет дальнейшей реакции до образования вышеуказанной ковалентной связи.

Изобретение относится, далее, к фармацевтическим композициям, которые содержат эти конъюгаты, как и к применению этих конъюгатов и композиций для профилактики или лечения организма человека или животного, а также к способам получения этих конъюгатов и композиций.

Используемый согласно изобретению гидроксиалкилкрахмал (HAS) можно получать одним из известных способов, например, путем гидроксиалкилирования крахмала в С₂- и/или С₆-положении ангидроглюкозных звеньев с помощью алкиленоксида или 2-хлоралканола, как, например, 2-хлорэтанол (см., например, патент США 5218108 в отношении гидроксиэтилирования крахмала), с различными желательными диапазонами молекулярной массы и степенями замещения. Также можно использовать любые, выпускаемые в продажу препаративные формы. Определение алкильной группировки в "гидроксиалкилкрахмале", используемое в данном описании, включает метил, этил, изопропил и н-пропил, причем особенно предпочтителен этил. Существенным преимуществом гидроксиэтилкрахмала (HES) является то, что он уже официально разрешен в качестве биосовместимого экспандера плазмы и широко используется в клинических условиях.

Средняя молекулярная масса гидроксиалкилкрахмала может составлять величину в диапазоне от примерно 3 кДа до нескольких миллионов дальтонов, предпочтительно от примерно 10 кДа до примерно 2000 кДа, более предпочтительно в диапазоне от примерно 70 кДа до примерно 1000 кДа, особенно предпочтительно составляет примерно 130 кДа. Для увеличения времени пребывания низкомолекулярного вещества в организме среднюю молекулярную массу гидроксиалкилкрахмала предпочтительно выбирают так, чтобы в случае конъюгатов превышалось гломерулярное пороговое значение 70 кДа. Степень замещения (соотношение числа модифицированных ангидроглюкозных звеньев к числу всех ангидроглюкозных звеньев) также может изменяться, и часто она составляет величину в диапазоне от примерно 0,2 до 0,8, предпочтительно от примерно 0,3 до 0,7, еще более предпочтительно составляет примерно 0,5. (Примечание: данные относятся к "степени замещения", которая составляет от 0 до 1.) Соотношение С₂-замещения к С₆-замещению обычно составляет величину в диапазоне от 4 до 16, предпочтительно в пределах от 8 до 12.

Эти параметры можно устанавливать известными способами. Опыты с применением гидроксиэтилкрахмала в качестве заменителя крови показали, что время пребывания HES в плазме зависит от молекулярной массы и степени и типа замещения (С₂-замещение или С₆-замещение), причем более высокая молекулярная масса, более высокая степень замещения и более высокая доля С₂-замещения увеличивают время пребывания.

Эти соотношения имеют значение также для предлагаемых согласно изобретению конъюгатов гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярных веществ, так что время пребывания определенного конъюгата в плазме устанавливается за счет доли полисахарида.

Как уже упоминалось, участвующая в реакции связывания функциональная группа молекулы гидроксиалкилкрахмала представляет собой концевую альдегидную группу или образующуюся из нее за счет химического превращения функциональную группу.

Примером такого химического превращения является селективное окисление этой альдегидной группы с помощью пригодного окислителя, как, например, иод, бром или некоторые ионы металлов, или также путем электрохимического окисления с образованием карбоксильной группы или активированной карбоксильной группы, например, сложного эфира, лактона, амида, причем карбоксильную группу, в случае необходимости, путем второй реакции превращают в активированное производное. Эту карбоксильную группу или активированную карбоксильную группу затем можно связывать с первичной аминогруппой или тиольной группой низкомолекулярного вещества при образовании амидной или сложной тиоэфирной связи. Другой возможностью является связывание с гидроксильной группой низкомолекулярного вещества при образовании сложного эфира.

Предлагаемый согласно изобретению конъюгат, однако, также можно получать тем, что для введения желательной функциональной группы низкомолекулярное вещество вводят во взаимодействие с пригодной, физиологически приемлемой бифункциональной линкерной молекулой. Остающуюся реакционноспособную группу связанной линкерной молекулы согласно настоящему изобретению рассматривают также как "реакционноспособную функциональную группу низкомолекулярного вещества".

Пригодные линкерные молекулы содержат на одном конце группу, которая может ковалентно связываться с реакционноспособной функциональной группой низкомолекулярного вещества, например, с аминогруппой, тиольной группой, карбоксильной группой или гидроксильной группой, и на другом конце - группу, которая также может ковалентно связываться с концевой альдегидной группой или образующейся из нее за счет химического превращения функциональной группой, например, карбоксильной группой, активированной карбоксильной группой, аминогруппой или тиольной группой. Между обеими функциональными группами линкерной молекулы находится биологически совместимая мостиковая молекула пригодной длины, например, группировка, которая производится от алкана, (олиго)алкиленгликольная группировка или другая пригодная олигомерная группировка. Предпочтительными группировками, которые могут реагировать с аминогруппами, являются, например, сложный N-гидроксисукцинимидоэфир, сложный сульфо-N-гидроксисукцинимидоэфир, сложный имидоэфир или другие активированные карбоксильные группы; предпочтительными группировками, которые могут реагировать с тиольными группами, являются, например, малеимидные и карбоксильные группы; предпочтительными группировками, которые могут реагировать с альдегидными или карбоксильными группами, являются, например, аминогруппы или тиольные группы.

Примерами линкерных молекул для связывания SH- и NH-групп являются:

AMAS(сложный N-α-(малеимидоацетокси)сукцинимидоэфир);BMPS(сложный N-β-(малеимидопропилокси)сукцинимидоэфир);GMBS(сложный N-γ-(малеимидобутирилокси)сукцинимидоэфир);EMCS(сложный N-ε-(малеимидокапроилокси)сукцинимидоэфир);MBS(сложный м-(малеимидобензоил)-N-гидроксисукцинимидоэфир);SMCCсукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат);SMPB(сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират);SPDP(сукцинимидил-3-(пиридилдитио)пропионат);сульфо-GMBS(сложный N-γ-(малеимидобутирилокси)сульфосукцинимидоэфир);сульфо-EMCS(сложный N-ε-(малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидоэфир).

Примерами линкерных молекул для связывания SH- и SH-групп являются:

ВМВ(1,4-бисмалеимидобутан);BMDB(1,4-бисмалеимидо-2,3-дигидроксибутан);ВМН(бисмалеимидогексан);ВМОЕ(бисмалеимидоэтан);DTME(дитиобисмалеимидоэтан);HBVS(1,6-гексанбисвинилсульфон);ВМ(РЕО)₃(1,8-бисмалеимидотриэтиленгликоль);ВМ(РЕО)₄(1,11-бисмалеимидотетраэтиленгликоль).

Примерами линкерных молекул для связывания NH- и NH-групп являются:

BSOCOES(бис(2-(сукцинимидилоксикарбонилокси)этил)сульфон);BS³(бис(сульфосукцинимидил)суберат);DFDNB(1,5-дифтор-2,4-динитробензол);DMA(диметиладипимидат.HCl);DSG(дисукцинимидилглутарат);DSS(дисукцинимидилсуберат);EGS(этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат)).

Примерами линкерных молекул для связывания SH- и CHO-групп являются:

ВМРН(соль ТФУК гидразида N-β-малеимидопропионовой кислоты);ЕМСА(гидразид N-ε-малеимидокапроновой кислоты);KMUH(гидразид N-κ-малеимидоундекановой кислоты);М₂С₂Н(4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксигидразид.HCl);MPBH(соль HCl гидразида 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты);PDPH(3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид).

Примером линкерной молекулы для связывания SH- и ОН-групп является PMPI (N-(п-малеимидофенил)изоцианат).

Примерами линкерных молекул для превращения SH-группы в СООН-группу являются:

ВМРА(N-β-малеимидопропионовая кислота);ЕМСН(N-β-малеимидокапроновая кислота);KMUA(N-κ-малеимидоундекановая кислота).

Примерами линкерных молекул для превращения NH-группы в СООН-группу являются MSA (метил-N-сукцинимидиладипат) или его гомологи с более длинной цепью или соответствующие производные этиленгликоля.

Примерами линкерных молекул для превращения СООН-группы в NH-группу являются DAB (1,4-диаминобутан) или его гомологи с более длинной цепью или соответствующие производные этиленгликоля.

Примером линкерной молекулы, которая реагирует с аминогруппой молекулы и приводит к образованию защищенной аминогруппы на большем расстоянии от этой молекулы для избежания пространственного затруднения, является TFCS (сложный N-e-(трифторацетилкапроилокси)сукцинимидоэфир).

Другие пригодные линкерные молекулы известны специалистам и имеются в продаже или могут предусматриваться в зависимости от потребности и в зависимости от имеющихся и желательных функциональных групп HAS и связываемых низкомолекулярных веществ и могут быть получены известными способами.

Согласно особенно предпочтительному способу получения, концевую альдегидную группу гидроксиалкилкрахмала (HAS) селективно окисляют в водном щелочном растворе с помощью молярного избытка иода, предпочтительно в молярном соотношении иода к HAS от 2:1 до 20:1, особенно предпочтительно от примерно 5:1 до 6:1. Согласно описанному в примере 1 оптимизированному способу, сначала гидроксиалкилкрахмал растворяют в горячей дистиллированной воде и добавляют немного меньше, чем 1 моль-эквивалент, водного раствора иода, предпочтительно в концентрации от примерно 0,05 н до 0,5 н, особенно предпочтительно примерно 0,1 н. Затем к реакционному раствору добавляют медленно, по каплям, с интервалом в несколько минут водный раствор NaOH в молярной концентрации, примерно 5-15-кратной, предпочтительно примерно 10-кратной, концентрации раствора иода, до тех пор, пока после добавления раствор начинает становиться снова прозрачным. К реакционному раствору снова добавляют менее чем 1 моль-эквивалент вышеуказанного водного раствора иода, снова начинают прикапывание раствора NaOH, и добавление иода и NaOH повторяют до тех пор, пока не добавят примерно 5,5-6 моль-эквивалентов раствора иода и 11-12 моль-эквивалентов раствора NaOH по отношению к гидроксиалкилкрахмалу. Затем реакцию прекращают, реакционный раствор обессоливают, например, путем диализа или ультрафильтрации, подвергают катионообменной хроматографии и продукт реакции получают путем лиофилизации. В случае этого способа, независимо от молекулярной массы HAS, достигают почти количественных выходов.

Согласно другому, особенно предпочтительному варианту осуществления, селективное окисление с помощью щелочных стабилизированных растворов ионов металлов, например, Cu⁺⁺ или Ag⁺, также происходит с почти количественным выходом (пример 2). При этом предпочтительно используют примерно 3-10-кратный молярный избыток окислителя.

Затем полученный селективно окисленный гидроксиалкилкрахмал в пригодном органическом растворителе вводят во взаимодействие с первичной аминогруппой желательного низкомолекулярного вещества при образовании амидной связи. Предпочтительные растворители выбирают из группы полярных апротонных растворителей, особенно предпочтительно используют диметилсульфоксид (ДМСО). В противоположность общепринятым, описанным в литературе способам в отношении подобных реакций связывания неожиданно показано, что нет необходимости в использовании в противном случае обязательных активаторов, как карбодиимиды и триазолы. Связывание селективно окисленного гидроксиэтилкрахмала (ох-HES) с различными модельными соединениями (см. примеры) без проблем протекает также в отсутствие активатора.

Предпочтительно, реакции связывания протекают в присутствии карбодиимида, более предпочтительно - в присутствии DCC (дициклогексилкарбодиимид), в высшей степени предпочтительно - в присутствии EDC (1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид).

Реакционноспособной группой молекулы гидроксиалкилкрахмала также может быть аминогруппа или тиольная группа, образующаяся за счет химического превращения концевой альдегидной группы. Например, можно осуществлять восстановительное аминирование альдегидной группы путем реакции с аммиаком в присутствии водорода и катализатора или в присутствии цианоборгидрида натрия. Образующаяся аминогруппа или тиольная группа затем может реагировать со свободной карбоксильной группой или альдегидной группой низкомолекулярного вещества. При этом сначала образуются амидные или сложные тиоэфирные связи, соответственно, основания Шиффа, которые, в случае необходимости, можно модифицировать за счет дальнейшей реакции.

Далее, концевую альдегидную группу молекулы гидроксиалкилкрахмала или образующуюся из нее за счет химического превращения функциональную группу можно также вводить во взаимодействие с пригодной, физиологически совместимой, бифункциональной линкерной молекулой. В этом случае для реакции связывания "функциональной группы, образующейся из концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала за счет химического превращения", используют остающуюся реакционноспособную функциональную группу бифункциональной линкерной молекулы, с которой вводят во взаимодействие концевую альдегидную группу или образующуюся из нее функциональную группу. Таким образом, концевую альдегидную группу также можно превращать в желательную функциональную группу.

Пригодные линкерные молекулы содержат на одном конце группировку, которая может ковалентно связываться с концевой альдегидной группой или образующейся из нее за счет химического превращения функциональной группой, например карбоксильной группой, активированной карбоксильной группой, аминогруппой или тиольной группой, и на другом конце - группировку, которая может ковалентно связываться с реакционноспособной функциональной группой низкомолекулярного вещества, например, с аминогруппой, тиольной группой, карбоксильной группой или ОН-группой, предпочтительно, арил-ОН-группой. Между обеими функциональными группами линкерной молекулы находится биологически приемлемая мостиковая молекула пригодной длины, например, группировка, которая производится от алкана, (олиго)алкиленгликолевая группировка или другая пригодная олигомерная группировка. Предпочтительными группировками, которые могут реагировать с аминогруппами, являются, например, сложный N-гидроксисукцинимидоэфир, сложный сульфо-N-гидроксисукцинимидоэфир, сложный имидоэфир или другие активированные карбоксильные группы; предпочтительными группировками, которые могут реагировать с тиольными группами, являются, например, малеимидные и карбоксильные группы; предпочтительными группировками, которые могут реагировать с альдегидными или карбоксильными группами, являются, например, аминогруппы или тиольные группы.

Ряд конкретных, не ограничивающих объема притязаний изобретения примеров пригодных линкерных молекул уже был указан выше в отношении конъюгации линкерных молекул с низкомолекулярными веществами.

В случае альтернативного способа связывания согласно настоящему изобретению, концевую альдегидную группу гидроксиалкилкрахмала (HAS) непосредственно вводят во взаимодействие с первичной аминогруппой низкомолекулярного вещества, соответственно, связанной с этим веществом линкерной молекулы при образовании основания Шиффа. Затем, или параллельно этому, образовавшееся основание Шиффа восстанавливают до амина путем введения во взаимодействие с пригодным восстановителем, благодаря чему в водной среде возникает стабильная связь между низкомолекулярным веществом и HAS.

Предпочтительными восстановителями являются боргидрид натрия, цианоборгидрид натрия, органические комплексы бора, например комплекс 4-(диметиламино)пиридина и бора, комплекс N-этилдиизопропиламина и бора, комплекс N-этилморфолина и бора, комплекс N-метилморфолина и бора, комплекс N-фенилморфолина и бора, комплекс лутидина и бора, комплекс триэтиламина и бора, комплекс триметиламина и бора; пригодными стереоселективными восстановителями являются, например, триацетатборгидрид натрия, триэтилборгидрид натрия, триметоксиборгидрид натрия, три-втор-бутилборгидрид калия (К-селектрид), три-втор-бутилборгидрид натрия (N-селектрид), три-втор-бутилборгидрид лития (L-селектрид), триамилборгидрид калия (KS-селектрид) и триамилборгидрид лития (LS-селектрид).

Реакцию связывания HAS или окисленного HAS с низкомолекулярным веществом из-за ожидаемой плохой водорастворимости вещества и недостаточной стабильности лактона в водной среде предпочтительно проводят в органическом растворителе, более предпочтительно - в полярном апротонном растворителе, в котором HAS и предпочтительно также низкомолекулярное вещество растворимы. Пригодными растворителями для HAS являются, например, ДМСО, гликоль, дигликоль, тригликоль, а также N-метилпирролидон. Также можно использовать смеси ДМСО с другими растворителями, если низкомолекулярное вещество нерастворимо в ДМСО или другом предпочтительном растворителе для HAS. Иногда реакцию можно осуществлять предпочтительно в гетерогенной фазе.

Молярное соотношение HAS к низкомолекулярному веществу при реакции связывания обычно составляет от примерно 20:1 до 1:1, предпочтительно от примерно 5:1 до 1:1.

Выход реакции связывания по отношению к низкомолекулярному веществу составляет, как правило, более чем 40%, часто более чем 60% и нередко более чем 80% (см. примеры).

В случае связываемого низкомолекулярного вещества речь идет предпочтительно о лекарственном биологически активном веществе, растворимость которого в водной среде и/или биодоступность, стабильность и время пребывания в организме которого нужно повышать. Под понятие "низкомолекулярное вещество" должны также подпадать пептиды, включающие вплоть до примерно 50 аминокислот. Лекарственное биологически активное вещество предпочтительно выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, антидепрессивных средств, антидиабетических средств, антидиуретиков, антихолинергических средств, антиаритмических средств, противорвотных средств, противокашлевых средств, антиэпилептических средств, противогистаминных средств, противогрибковых средств, противосимпатотонических средств, антитромботических средств, андрогенов, антиандрогенов, эстрогенов, антиэстрогенов, средств против остеопороза, противоопухолевых средств, вазодилататоров, других, снижающих кровяное давление средств, уменьшающих лихорадку средств, анальгетиков, подавляющих воспаление средств, β-блокаторов, иммуносупрессоров и витаминов.

Некоторыми, не ограничивающими объема притязаний изобретения примерами лекарственных биологически активных веществ с NH₂-группой в качестве компонента реакции связывания с HAS являются: албутерол, алендронат, амиказин, ампициллин, амоксициллин, амфотерицин В, атенолол, азатиоприн, цефаклор, цефадроксил, цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон, циластатин, циметидин, ципрофлоксацин, клонидин, колистин, косинтропин, циклосерин, даунорубицин, доксорубицин, десмопрессин, дигидроэрготамин, добутамин, допамин, эфедрин, эпинефрин, e-аминокапроновая кислота, эргометрин, эсмолол, фамотидин, флекаинид, фолевая кислота, флуцитозин, фуросемид, ганцикловир, гентамицин, глюкагон, гидразалин, имипенем, изопротеренол, кетамин, лиотиронин, лутилиберин, мерпатрицин, метараминол, метилдопа, метоклопрамид, метопролол, мексилетин, митомицин, неомицин, нетилмицин, нимодипин, нистатин, октреотид, окситоцин, памидронат, пентамидин, фентоламин, фенилэфрин, прокаинамид, прокаин, пропранолол, ритодрин, соталол, теикопланин, тербуталин, тиамин, тилудронат, толазолин, триметоприм, трометамин, ванкомицин, вазопрессин и винбластин.

Предпочтительными примерами лекарственных биологически активных веществ с NH₂-группой в качестве компонента реакции связывания с HAS являются: 6-аминопенициллиновая кислота, 7-аминоцефалоспорин, 7-аминоцефалоспорановая кислота и 7-аминопенициллановая кислота.

Конкретными примерами таких биологически активных веществ с СООН-группой в качестве компонента реакции связывания с HAS являются: ацетилцистеин, азлоциллин, азтреонам, бензилпенициллин, камптотецин, цефамандол, цефазолин, цефепим, цефотаксим, цефотетан, цефокситин, цефтазидим, цефтриаксон, цефалотин, циластатин, ципрофлоксацин, клавулановая кислота, диклоксациллин, e-аминокапроновая кислота, флоксациллин, формилтетрагидрофолиевая кислота, фуросемид, фузидиевая кислота, имипемем, индометацин, кеторолак, лиотиронин, мелфалан, метилдопа, пиперациллин, простациклин, простагландины, теикопланин, тикарциллин и ванкомицин.

Конкретными примерами таких биологически активных веществ с арил-ОН-группой в качестве компонента реакции связывания с HAS являются: албутерол, аллопуринол, апоморфин, цефтриаксон, добутамин, допамин, доксициклин, эдрофониум, изопротеренол, лиотиронин, метараминол, метилдопа, миноциклин, пентазоцин, фенилэфрин, фентоламин, пропофол, рифамицин, ритодрин, теикопланин, тербуталин, тетрациклин и ванкомицин.

Конкретными примерами таких биологически активных веществ с алифатической ОН-группой в качестве компонента реакции связывания с HAS являются таксол и палцитаксел.

Продукты реакции вышеописанного химического связывания можно исследовать известными способами и установить эффективность связывания. Например, можно строить УФ-калибровочную кривую для соответствующего низкомолекулярного вещества и использовать ее для определения содержания низкомолекулярного вещества в пробе, соответственно, долю низкомолекулярного вещества в продукте, полученном путем реакции связывания. В случае, если низкомолекулярное вещество не обладает никакой УФ-абсорбцией, можно разработать соответствующие колориметрические или электрохимические способы обнаружения по аналогии с известными способами. Долю сахарида в конъюгате можно определять, например, путем специфичного по отношению к гликану окрашивания выделенных продуктов реакции. Также возможно количественное определение гликана. Выход продуктов реакций связывания при участии первичных аминов можно устанавливать также путем модификации непрореагировавших аминов с помощью флуорескамина и определения флуоресценции.

Повышенную водорастворимость в случае труднорастворимых исходных веществ можно контролировать просто путем опытов по растворению. В случае связывания с частично водорастворимыми лекарственными биологически активными веществами повышенную гидрофильность можно устанавливать посредством OECD-метода для определения значения logP. Он коррелирует время удерживания вещества согласно высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенными фазами с коэффициентами распределения в смеси н-октанол/вода. Все исследованные этим методом HES-конъюгаты согласно изобретению элюируются в выведенном объеме из колонки с С18-фазой, следовательно, не вступают ни в какие взаимодействия с С18-фазой.

Конъюгаты согласно настоящему изобретению, в случае необходимости, можно использовать как таковые или в виде фармацевтической композиции для профилактики или лечения организма человека или животного.

Такого рода композиции включают фармацевтически эффективное количество предлагаемого согласно изобретению конъюгата в качестве активного компонента, а также фармацевтически пригодный носитель и, в случае необходимости, другие терапевтические, соответственно, галеновые компоненты или вспомогательные вещества. Вспомогательные вещества могут включать, например, разбавители, буферы, улучшающие вкус вещества, связующие, поверхностно-активные вещества, загустители, придающие скользкость таблеткам вещества, консерванты (включая антиоксиданты), также как вещества, которые служат для придания композиции изотоничности с кровью предусматриваемого реципиента. Фармацевтически эффективным количеством является количество, достаточное для проявления желательного положительного действия при одноразовом или многоразовом введении в рамках лечения для облегчения, излечивания или предотвращения болезненного состояния. Фармацевтически подходящим носителем является носитель, который совместим как с лекарственным биологически активным веществом, так и с организмом пациента.

Форма композиции изменяется в зависимости от желательного или пригодного пути введения. Пригодными путями введения могут быть, например, пероральное, парентеральное, например, подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраартикулярное, интратекальное введение; экстрадуральная инъекция, в случае необходимости, инфузия; внутриносовое, интратрахеальное, ректальное или локальное введение. Фармацевтические композиции более благоприятно могут находиться в форме разовой дозы и их можно получать любым из хорошо известных в области фармацевтики способов.

HAS-конъюгаты согласно настоящему изобретению можно использовать также в любых других областях, в которых применяют другие полимерные конъюгаты, например, ПЭГ-конъюгаты. Некоторыми конкретными, не ограничивающими объема притязаний изобретения примерами являются применение HAS-конъюгата в качестве иммобилизированного компонента реакции для проведения реакции в гетерогенной фазе или в качестве колоночного материала для аффинной хроматографии. Другие возможности применения для специалиста очевидны исходя из раскрытых в настоящем описании свойств предлагаемых согласно изобретению HAS-конъюгатов.

Следующие примеры должны подробнее пояснять изобретение, однако, не ограничивая его объема притязаний. В особенности можно осуществлять аналогичные реакции также при использовании гидроксиметилкрахмала и гидроксипропилкрахмала и достигать подобных результатов.

Пример 1

Селективное окисление гидроксиэтилкрахмала (HES) с помощью иода

В круглодонной колбе 10 г HES с молекулярной массой 130 кДа при нагревании растворяют в 12 мл деионизированной воды. К этому раствору добавляют 2 мл 0,1 н раствора I₂. Пипетку с 2 мл 1,0 н раствора NaOH связывают с колбой через двустороннюю соединительную часть и прикапывают раствор NaOH со скоростью примерно 1 капля в 4 минуты. После добавления приблизительно 0,2 мл раствора NaOH раствор обесцвечивается, в этот момент добавляют вторую порцию 2 мл 0,1 н раствора иода. После добавления в целом 14 мл раствора иода и 2,8 мл раствора NaOH реакция заканчивается. Реакционную смесь затем подвергают диализу против деионизированной воды.

Лактонизация

Частично обессоленный раствор подвергают хроматографии на колонке с катионообменником (амберлит IR-120; H⁺-форма) для превращения альдонатных групп в группы альдоновой кислоты. Затем воду удаляют путем лиофилизации и таким образом получают лактоновую форму.

Определение степени окисления

К, соответственно, 1 мл раствора пробы в атмосфере азота пипеткой добавляют 1 мл щелочного, содержащего медь реагента (3,5 г Na₂PO₄, 4,0 г K-Na-тартрата в 50 мл воды, сверх того, 10 мл 1 н раствора NaOH, 8,0 мл 10%-ного (масса/объем) раствора CuSO₄ и 0,089 г иодата калия в 10 мл воды, после добавления 18 г сульфата натрия дополняют до 100 мл). Нагревают в течение 45 минут при температуре 100°С. После охлаждения добавляют 0,2 мл 2,5%-ного раствора KI и 0,15 мл 2М H₂SO₄. Спустя 5 минут смешивают с 1 каплей раствора индикатора фенолового красного (1% масса/объем) и титруют с помощью 5 мМ раствора Na₂S₂O₃ вплоть до исчезновения окраски. Из расхода средства для титрования можно рассчитывать концентрацию непрореагировавших альдегидных групп.

Достигают примерно количественного выхода (>98%). Гидроксиэтилкрахмалы с более высокой молекулярной массой (например, 130 кДа, 250 кДа, 400 кДа), точно так же, как гидроксиэтилкрахмалы с более низкой молекулярной массой (например, 10 кДа, 25 кДа, 40 кДа), можно окислять по этой методике с получением подобных высоких выходов.

Пример 2

Селективное окисление гидроксиэтилкрахмала с помощью ионов Cu²⁺

При нагревании готовят раствор 0,24 ммоль гидроксиэтилкрахмала (HES) с молекулярной массой 130 кДа в 10 мл деионизированной воды. Этот раствор в круглодонной колбе емкостью 100 мл нагревают до температуры 70-80°С и смешивают с 1,17 ммоль стабилизированного Cu²⁺ (например, соль Rochelle в качестве стабилизатора или другие стабилизаторы) и водным разбавленным раствором NaOH (конечная концентрация 0,1 н NaOH). Затем температуру повышают до 100°С и реакцию проводят до тех пор, пока не появится красноватое окрашивание. Реакцию прекращают и реакционную смесь охлаждают до температуры 4°С. Красноватый осадок удаляют путем отфильтровывания. Фильтрат подвергают диализу против деионизированной воды и затем превращают в лактон, как описано в примере 1. Окисление протекает количественно (выход >99%). По этой методике можно окислять также низкомолекулярный HES (например, с молекулярной массой 10 кДа, 25 кДа, 40 кДа) и более высокомолекулярный HES (например, с молекулярной массой 130 кДа, 250 кДа, 400 кДа).

Пример 3

Связывание селективно окисленного гидроксиэтилкрахмала (ox-HES) с алендронатом

В круглодонной колбе емкостью 100 мл 5 мг алендроната (бисфосфонат) и 3-5-кратный молярный избыток лактона ox-HES (полученного, как описывается в примере 1 или 2) растворяют в 405 мл диметилсульфоксида. Суспензию нагревают до температуры 70°С и при умеренном перемешивании (магнитная мешалка) выдерживают в течение 24-36 часов. Реакцию затем прекращают и реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. После этого добавляют 20-30 мл воды и этот раствор подвергают диализу против дистиллированной воды. Вместо диализа можно использовать также ультрафильтрацию с пригодным пороговым значением мембраны в отношении молекулярной массы. Это делает возможным не только обмен растворителя, но также концентрирование раствора, который затем лиофилизируют. Степень осуществления связывания обнаруживают с помощью аналитических стандартных способов, например, путем гельпроникающей хроматографии и теста с нингидрином на свободные аминогруппы. Выход продукта связывания составляет примерно 85% для связывания с ox-HES с молекулярной массой 130 кДа и примерно 80% для связывания с лактоном ox-HES с молекулярной массой 10 кДа.

Пример 4

Связывание селективно окисленного HES (ox-HES) с амфотерицином В

12,0 г высушенного лактона ox-HES с молекулярной массой 130 кДа в атмосфере азота растворяют в 30 мл безводного диметилсульфоксида. Раствор нагревают до температуры 70°С и добавляют 52 мг амфотерицина В. В отсутствие света реакционную смесь выдерживают в этих условиях в течение 24 часов. Обнаружение связывания осуществляют путем гель проникающей хроматографии с фотометрическим детектированием при 385 нм (λ_max амфотерицина). После прекращения реакции за счет добавления 80 мл дистиллированной воды реакционную смесь интенсивно диализуют против воды. Путем лиофилизации получают продукт связывания слабо-желтого цвета. (Выход примерно 87%.)

В сравнимых условиях при связывании лактона ox-HES с молекулярной массой 10 кДа с амфотерицином В достигают выхода примерно 75%.

Пример 5

Связывание ox-HES с ампициллином

В круглодонной колбе емкостью 100 мл 1,3 г сухого лактона ox-HES с молекулярной массой 130 кДа растворяют 5 мл безводного диметилсульфоксида. Этот раствор нагревают до температуры 45°С и добавляют 11,0 мг ампициллина (Aldrich # 27.186-1). Реакция протекает при умеренном перемешивании в течение 20 часов и затем ее прекращают путем добавления 25 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь диализуют против дистиллированной воды и затем лиофилизируют. Степень связывания определяют путем анализа продукта с помощью гельпроникающей хроматографии и свободные аминогруппы ампициллина обнаруживают с помощью нингидрина.

Пример 6

Связывание ох-HES с неомицином

В реакционном сосуде емкостью 50 мл при перемешивании магнитной мешалкой и при температуре 60°С 3×10^-5 моль лактона ох-HES с молекулярной массой 25 кДа растворяют в 5 мл N-метилпирролидона. После добавления 10 мг неомицина в 2 мл безводного диметилсульфоксида кипятят с обратным холодильником в течение приблизительно 10 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакцию прекращают путем добавления дальнейших 35 мл воды. Путем диализа удаляют преобладающую часть растворителя и полученный в результате связывания продукт затем лиофилизируют. С помощью гельпроникающей хроматографии с УФ-детектированием можно обнаружить полученный в результате связывания продукт с выходом примерно 82%.

Пример 7

Связывание ох-HES с мепатрицином

Для растворения полностью при нагревании 2,5 г лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа и 22 мг мепатрицина (выпускается фирмой Societa Prodotti Antibiotici, Mailand, Италия) требуется 10 мл этиленгликоля. Растворитель перед этим подвергают дегазации и сушат. Реакционный раствор перемешивают в течение 36 часов в отсутствие света и в атмосфере инертного газа, и реакцию, наконец, прекращают путем введения 40 мл ледяной воды. Этиленгликоль отделяют путем ультрафильтрации (10 кДа-мембрана), затем путем лиофилизации получают 2,1 г порошка слабо-желтоватого цвета. Дальнейшую очистку осуществляют путем ВЭЖХ с обращенными фазами на колонке с фазой С18 при детектировании в ультрафиолетовой/видимой области спектра.

Пример 8

Связывание ох-HES с нистатином

В круглодонной колбе емкостью 100 мл 2,5 г сухого лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа растворяют в 10 мл безводного диметилсульфоксида. После добавления 9,5 мг нистатина нагревают до температуры 60°С и перемешивают в атмосфере инертного газа и в темноте. Реакция протекает при умеренном перемешивании в течение 48 часов и затем ее прекращают путем добавления 50 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь диализуют против дистиллированной воды и затем лиофилизируют. Связывание можно обнаруживать путем ВЭЖХ с обращенными фазами (колонка с С18) и детектирования при 325 нм. Выход, определяемый на основании абсорбции по пику продукта, составляет примерно 67%.

Пример 9

Связывание ох-HES с митомицином С

2,5 г лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа и 20 мг митомицина (Fluka # 69824) при температуре 60°С растворяют в смеси диметилсульфоксида и метанола в соотношении 9:1. Реакционный раствор выдерживают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 24 часов и после этого для прекращения реакции добавляют 40 мл воды. Этот раствор диализуют в течение ночи против деионизированной воды и затем подвергают сушке вымораживанием. Обнаружение связывания осуществляют посредством ВЭЖХ с обращенными фазами и детектирования при 320 нм. Ожидаемый продукт связывания получают с выходом 82%.

Пример 10

Связывание ох-HES с даунорубицином

1,3 г лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа при температуре 70°С и при перемешивании растворяют в 10 мл N-метилпирролидона. К полученному раствору добавляют по каплям раствор 17 мг даунорубицина (Fluka # 30450) в 3 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 часов в этих условиях, охлаждают до комнатной температуры и, наконец, встряхивают с 40 мл дистиллированной воды. Посредством диализа против воды удаляют основную часть растворителя и затем подвергают сушке вымораживанием. Связанный даунорубицин обнаруживают путем ВЭЖХ с обращенными фазами и детектирования в ультрафиолетовой/видимой области спектра.

Пример 11

Связывание ох-HES с 7-аминоцефалоспорином

В круглодонной колбе емкостью 100 мл при перемешивании магнитной мешалкой 3,0 г лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа и 20 мг 7-аминоцефалоспорина (Fluka # 07300) растворяют в 5 мл безводного диметилсульфоксида. Температуру повышают до 50°С и выдерживают в течение 15 часов. По истечении этого времени охлаждают до температуры 25°С и реакционную смесь разбавляют путем добавления 5 мл дистиллированной воды. Диметилсульфоксид и непрореагировавший 7-аминоцефалоспорин удаляют путем диализа против дистиллированной воды. Раствор затем лиофилизируют и продукт анализируют путем тонкослойной хроматографии (ТСХ) и гельпроникающей хроматографии.

Пример 12

Связывание ох-HES с 6-аминопенициллиновой кислотой

Осуществляют описанную в примере 11 реакцию в тех же условиях при использовании 16 мг 6-аминопенициллиновой кислоты вместо 7-аминоцефалоспорина и продукт реакции обрабатывают и анализируют в тех же условиях.

Пример 13

Связывание ох-HES с LHRH

1,0 г высушенного лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа с 5 мг LHRH (лютилиберин; "люитенизирующего гормона высвобождающий гормон") (Bachem, Швейцария) инкубируют в 10 мл диметилсульфоксида. Реакцию проводят в течение 15 часов при температуре 45°С при перемешивании и прекращают путем добавления 40 мл воды. Связанный с HES LHRH, после экстенсивного диализа против воды для удаления основного количества диметилсульфоксида и непрореагировавшего пептида, получают путем лиофилизации. Образовавшийся продукт анализируют путем гельпроникающей хроматографии (супероза 12; Amersham-Pharmacia, Швеция) и УФ-детектирования при 280 нм. Для полученного в результате связывания продукта стехиометрию приблизительно 1:1 получают из определения пептида путем Trp-абсорбции и определения доли полисахарида путем окрашивания фенолом/серной кислотой.

Пример 14

Связывание ох-HES с камптотецином

В круглодонной колбе при температуре 50°С 20 мг камптотецина растворяют в 5 мл безводного диметилсульфоксида. К этому раствору прикапывают раствор 36 мг 1,4-диаминобутана в 2 мл безводного диметилсульфоксида. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 часов в этих условиях и слегка перемешивают. Продукт конъюгации очищают флэш-хроматографией. Выход составляет примерно 83%.

Для реакции связывания модифицированного камптотецина с ох-HES с молекулярной массой 130 кДа всю реакционную смесь после очистки вместе с 3,6 г лактона полисахарида при перемешивании и нагревании до температуры 50°С растворяют в 8 мл безводного диметилсульфоксида. За протеканием реакции следят с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами проб из реакционной смеси. После выдерживания в течение 20 часов при температуре 50°С более не наблюдается никакого дальнейшего образования продукта, и реакцию прекращают путем добавления 50 мл дистиллированной воды. После диализа против воды полученный в результате связывания продукт подвергают сушке вымораживанием. Анализ осуществляют путем гельпроникающей хроматографии и окрашивания свободной аминогруппы в модифицированном, непрореагировавшем камптотецине с помощью нингидрина на ТСХ-пластине.

Пример 15

Связывание ох-HES с простациклином

а) Аминофункционализация

352 мг простациклина (Sigma-Aldrich) при температуре 0°С растворяют в 5 мл безводного диметилформамида с 2% дихлорметана (объем/объем). К полученному раствору добавляют 1,3 г дициклогексилкарбодиимида (DCC) в 5 мл безводного диметилформамида. Слегка перемешивая, выдерживают в течение 30 минут. Затем добавляют 5-кратный молярный избыток (по отношению к простациклину) простого 1,5-диаминоэтилового эфира и раствор медленно нагревают до комнатной температуры. Очистку аминофункционализированного продукта связывания осуществляют флэш-хроматографией на фазе из диоксида кремния.

b) Связывание с HES

220 мг очищенного продукта связывания со стадии а) при комнатной температуре растворяют в 8 мл гликоля. С полученным раствором при перемешивании смешивают раствор 4,0 г лактона ох-HES с молекулярной массой 130 кДа в 10 мл гликоля и нагревают до температуры 45°С. Через 8 часов охлаждают на бане со льдом и интенсивно диализуют против воды. Прозрачный раствор исследуют путем ВЭЖХ с обращенными фазами на колонке с С18. Из соотношения площадей в выведенном объеме из колонки (продукт связывания) и исходного вещества можно рассчитывать эффективность связывания. Выход составляет 53%.

Пример 16

Связывание HES с алендронатом

В круглодонной колбе емкостью 100 мл к раствору 2,25 мг алендроната в 4 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7,5) добавляют десятикратный молярный избыток HES с молекулярной массой 25 кДа. Реакционную смесь встряхивают для полного растворения полисахарида и затем добавляют тридцатикратный молярный избыток NaBH₃CN. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 48 часов, причем образование продукта связывания определяют в аликвоте путем взаимодействия с флуорескамином, который со свободными аминогруппами дает флуоресцирующий продукт.

Пример 17

Связывание HES с амоксиллином

В двугорлую колбу вносят 4,0 мл 0,1 н. натрийфосфатного буфера (рН 7,5) и в нем при температуре 60°С растворяют 1,5 г HES с молекулярной массой 40 кДа. После охлаждения до температуры 25°С при перемешивании магнитной мешалкой добавляют 7,0 мг амоксиллина (Fluka # 10039). В отдельном сосуде приготовляют раствор NaBH₃CN, который соответствует тридцатикратному молярному избытку, в 2 мл такого же натрийфосфатного буфера. С помощью капельной воронки раствор цианоборгидрида медленно прикапывают к первому раствору в течение периода времени 30 минут. Реакционную смесь перемешивают далее в течение 24-36 часов и затем, для прекращения реакции, с помощью 0,1 н HCl устанавливают значение рН 4. Раствор обессоливают путем диализа и лиофилизируют. Обнаружение продукта связывания осуществляют с помощью гельпроникающей хроматографии и УФ-фотометра.

Пример 18

Связывание HES с цефаклором

В круглодонную колбу емкостью 100 мл вносят 4 мл 0,1 н. натрийфосфатного буфера (рН 7,0), используемого для растворения 110 мг NaBH₃CN. При перемешивании добавляют 6,0×10^-5 моль HES с молекулярной массой 130 кДа и 2,0×10^-5 моль цефаклора (Fluka # 22125). Температуру реакции поддерживают при 25°С и реакционную смесь умеренно перемешивают в течение 24 часов. Затем раствор подкисляют до значения рН 4,0 и перемешивают в течение следующих 30 минут; для обессоливания и концентрирования подвергают ультрафильтрации (10 кДа-мембрана). Продукт связывания обнаруживают посредством гельпроникающей хроматографии высокого давления (HP-GPC) при 265 нм.

Пример 19

Связывание HES с доксорубицином

6,0 мг доксорубицина (Fluka # 45584) в присутствии трехкратного молярного избытка HES с молекулярной массой 130 кДа суспендируют в 4 мл 0,1 н. натрийфосфатного буфера (рН 7,5) при комнатной температуре. Реакционную смесь в течение 30 минут интенсивно перемешивают и медленно смешивают с 3 мл 0,8 М раствора NaBH₃CN. Реакционную смесь выдерживают при перемешивании в течение 48 часов при комнатной температуре. Затем ее подвергают диафильтрации при использовании 10 кДа-мембраны для удаления солей и непрореагировавшего доксорубицина. Подвергнутый диафильтрации раствор лиофилизируют и продукт связывания исследуют путем гельпроникающей хроматографии и ВЭЖХ с обращенными фазами.

Пример 20

Связывание HES с вазопрессином

В круглодонной колбе, снабженной капельной воронкой, 1,25 г HES с молекулярной массой 130 кДа при нагревании и слегка перемешивая растворяют в 5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, рН 8,0. К этому раствору добавляют 5 мг вазопрессина (Bachem, Швейцария). В 2 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5) растворяют 30 мг NaBH₃CN и через капельную воронку медленно прикапывают к реакционной смеси. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 часов при температуре 25°С. Для прекращения реакции снижают значение рН до 4,0 путем добавления 0,1 н HCl. После экстенсивного диализа против воды связанный с HES продукт подвергают сушке вымораживанием. Анализ осуществляют путем гельпроникающей хроматографии, как описывается выше, и УФ-детектирования при 220 нм.

Пример 21

Связывание ох-HES с молекулярной массой 70 кДа с неомицином

В двугорлой колбе, в атмосфере аргона, 1,01 г неомицина (сульфат) и 126,21 мг ох-HES с молекулярной массой 70 кДа растворяют в 2 мл диметилсульфоксида и после добавления 0,81 мг DMAP (4-диметиламинопиридина) нагревают в течение 24 часов при температуре 70°С. Затем реакцию прекращают путем добавления ацетона, при этом осаждается продукт связывания. Твердое вещество растворяют в воде и очищают в течение 48 часов путем диализа против воды. После сушки вымораживанием получают 80 мг продукта связывания белого цвета (63%).

Пример 22

Альтернативный способ связывания ох-HES с молекулярной массой 70 кДа с неомицином

Связывание неомицина с ох-HES с молекулярной массой 70 кДа также успешно можно осуществлять при комнатной температуре в диметилсульфоксиде при добавлении EDC в качестве активатора. Для этого 16,97 мг неомицина (сульфат), 348 мг ох-HES с молекулярной массой 70 кДа и 2,28 мг DMAP растворяют в 1 мл диметилсульфоксида. После добавления 3,83 мг дициклогексилкарбодиимида (1 эквивалент) раствор перемешивают в течение 2 часов и повторно добавляют один эквивалент дициклогексилкарбодиимида. Этот способ повторяют вплоть до введения 10 эквивалентов дициклогексилкарбодиимида в реакционный раствор. Время реакции составляет в целом 24 часа. После добавления в раствор 20 мл ацетона продукт связывания осаждается. Твердое вещество растворяют в воде и в течение 48 часов очищают путем диализа против воды. После сушки вымораживанием получают 280 мг продукта связывания белого цвета (80%).

Пример 23

Связывание ох-HES с молекулярной массой 70 кДа с даунорубицином

В двугорлой колбе 0,5 мг даунорубицингидрохлорида, 829,0 мг ох-HES с молекулярной массой 70 кДа и 0,108 мг DMAP в атмосфере аргона растворяют в 2 мл диметилсульфоксида и нагревают в течение 24 часов при температуре 70°С. Затем туда добавляют 20 мл ацетона, при этом осаждается продукт связывания. Раствор центрифугируют и преципитат многократно промывают ацетоном и центрифугируют. Получают окрашенное в слегка розовый цвет твердое вещество, которое растворяют в воде и полученный раствор диализуют против воды. После сушки вымораживанием получают 656 мг (80%) окрашенного в слегка розовый цвет твердого вещества. Чистоту связанного даунорубицина определяют путем ВЭЖХ с обращенными фазами.

Пример 24

Связывание ох-HES с молекулярной массой 130 кДа с 7-аминоцефалоспорановой кислотой

В круглодонной колбе емкостью 100 мл 383 мг ох-HES с молекулярной массой 130 кДа и 1,22 мг 7-аминоцефалоспорановой кислоты (Fluka # 07300) при перемешивании магнитной мешалкой растворяют в 2 мл безводного диметилсульфоксида. Температуру повышают до 70°С и поддерживают в течение 24 часов. Спустя это время охлаждают до температуры 25°С и продукт реакции осаждают за счет добавления 20 мл ацетона. Твердое вещество промывают с помощью 20 мл ацетона и растворяют в 20 мл дистиллированной воды. Дальнейшую очистку продукта связывания осуществляют путем диализа против дистиллированной воды. Раствор затем подвергают лиофилизации и продукт анализируют путем ТСХ и гельпроникающей хроматографии. Получают 270 мг продукта связывания (70%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 25

Связывание ох-HES с молекулярной массой 70 кДа с 6-аминопенициллановой кислотой

Описанную в примере d реакцию осуществляют также в тех же условиях при использовании 1,57 мг 6-аминопенициллановой кислоты вместо 7-аминоцефалоспорановой кислоты и 135,54 мг ox-HES с молекулярной массой 70 кДа. Продукт реакции обрабатывают и анализируют в тех же условиях. После очистки получают 88 мг продукта связывания (65%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 26

Связывание HES с молекулярной массой 40 кДа с амоксициллином

В двугорлую колбу вводят 4,0 мл 0,1 н натрийфосфатного буфера (рН 7,5) и при нагревании до температуры 60°С в нем растворяют 1,5 г HES с молекулярной массой 40 кДа. После охлаждения до температуры 25°С при перемешивании магнитной мешалкой добавляют 7,0 мг амоксициллина (Fluka # 10039). В отдельном сосуде приготовляют раствор NaBH₃CN, который соответствует тридцатикратному молярному избытку, в 2 мл такого же натрийфосфатного буфера. С помощью капельной воронки раствор цианоборгидрида медленно прикапывают к первому раствору в течение 30 минут. Реакционную смесь перемешивают далее в течение 24-36 часов и затем для прекращения реакции с помощью 0,1 н HCl устанавливают значение рН 4. Раствор обессоливают путем диализа и лиофилизируют. Обнаружение продукта связывания осуществляют с помощью гельпроникающей хроматографии и УФ-фотометра.

Пример 27

Связывание ох-HES с молекулярной массой 70 кДа с амоксициллином

В круглодонной колбе емкостью 100 мл 173 мг ох-HES с молекулярной массой 70 кДа и 0,85 мг амоксициллина при перемешивании магнитной мешалкой растворяют в 2 мл безводного диметилсульфоксида. Температуру повышают до 70°С и поддерживают в течение 24 часов. По истечении этого времени охлаждают до температуры 25°С и продукт реакции осаждают за счет добавления 20 мл ацетона. Твердое вещество промывают с помощью 20 мл ацетона и растворяют в 20 мл дистиллированной воды. Дальнейшую очистку продукта связывания осуществляют путем диализа против дистиллированной воды. Раствор затем подвергают лиофилизации и продукт анализируют путем ТСХ и гельпроникающей хроматографии. Получают 151 мг продукта связывания (87%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 28

Связывание ox-HES с молекулярной массой 70 кДа с цефадроксилом

В круглодонной колбе емкостью 100 мл 610 мг ох-HES с молекулярной массой 70 кДа и 2,965 мг цефадроксила при перемешивании магнитной мешалкой растворяют в 2 мл безводного диметилсульфоксида. Температуру повышают до 70°С и поддерживают в течение 24 часов. Затем охлаждают до температуры 25°С и продукт реакции осаждают за счет добавления 20 мл ацетона. Твердое вещество промывают с помощью 20 мл ацетона и растворяют в 20 мл дистиллированной воды. Дальнейшую очистку продукта связывания осуществляют путем диализа против дистиллированной воды. Раствор затем подвергают лиофилизации и продукт анализируют путем ТСХ и гельпроникающей хроматографии. Получают 490 мг продукта связывания (87%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 29

Связывание ox-HES с молекулярной массой 70 кДа с глюкагоном

В круглодонной колбе 0,23 мг (66×10^-9 моль) глюкагона, 123 мг (6,6×10^-6 моль) ох-HES с молекулярной массой 70 кДа растворяют в 1 мл диметилсульфоксида. В реакционный раствор с интервалом в 1 час добавляют в виде 8 порций дициклогексилкарбодиимид (DCC) вплоть до добавления в целом 23,08 мг. После времени реакции 24 часа реакцию прекращают путем добавления 15 мл воды. Продукт связывания очищают путем диализа против воды. После сушки вымораживанием получают 79 мг продукта связывания белого цвета (65%).

Описан конъюгат гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярного вещества, в котором связывающее взаимодействие между молекулой гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярным веществом основано на ковалентной связи, которая образуется в результате реакции связывания между (i) концевой альдегидной группой или карбоксильной группой, образующейся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы, или активированной карбоксильной группой, полученной превращением указанной карбоксильной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала и (ii) функциональной группой низкомолекулярного вещества, выбранной из группы, состоящей из аминогруппы, карбоксильной группы, тиоловой группы и гидроксильной группы, которая является реакционноспособной по отношению к этой альдегидной группе или карбоксильной группе или происходящей от нее, активированной карбоксильной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, при этом связь, образующаяся непосредственно при реакции связывания, может быть в случае необходимости модифицирована дальнейшей реакцией до образования вышеуказанной ковалентной связи. Использование конъюгата позволяет увеличивать продолжительность пребывания низкомолекулярных веществ в плазме крови. 4 н. и 30 з.п. ф-лы.

1. Конъюгат гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярного вещества, отличающийся тем, что связывающее взаимодействие между молекулой гидроксиалкилкрахмала и низкомолекулярным веществом основано на ковалентной связи, которая образуется в результате реакции связывания между (i) концевой альдегидной группой или карбоксильной группой, образующейся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы, или активированной карбоксильной группой, полученной превращением указанной карбоксильной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала и (ii) функциональной группой низкомолекулярного вещества, выбранной из группы, состоящей из аминогруппы, карбоксильной группы, тиоловой группы и гидроксильной группы, которая является реакционноспособной по отношению к этой альдегидной группе или карбоксильной группе или происходящей от нее активированной карбоксильной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, при этом связь, образующаяся непосредственно при реакции связывания, в случае необходимости, может быть в случае необходимости модифицирована дальнейшей реакцией до образования вышеуказанной ковалентной связи.2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что карбоксильной группой или активированной карбоксильной группой молекулы гидроксиалкилкрахмала является одна из функциональных групп бифункциональной линкерной молекулы, с которой взаимодействует концевая альдегидная группа или карбоксильная группа, образующаяся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы, или активированная карбоксильная группа, полученная превращением указанной карбоксильной группы.3. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что аминогруппой, карбоксильной группой, тиоловой группой или гидроксильной группой низкомолекулярного вещества является одна из функциональных групп бифункциональной линкерной молекулы, которая связана с низкомолекулярным веществом.4. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что ковалентная связь образуется в результате реакции связывания между карбоксильной группой, образовавшейся путем селективного окисления концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала, или активированной карбоксильной группой и первичной аминогруппой или тиольной группой низкомолекулярного вещества.5. Конъюгат по п.4, отличающийся тем, что ковалентной связью является амидная связь, которая образуется в результате реакции связывания между лактоном, образовавшимся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала, и первичной аминогруппой низкомолекулярного вещества.6. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что ковалентной связью является аминная связь, которая образуется в результате реакции связывания между концевой альдегидной группой молекулы гидроксиалкилкрахмала и первичной аминогруппой низкомолекулярного вещества с образованием основания Шиффа и восстановления основания Шиффа до получения амина.7. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что молекула гидроксиалкилкрахмала имеет молекулярную массу в диапазоне от примерно 70 кДа до примерно 1000 кДа.8. Конъюгат по п.7, отличающийся тем, что молекула гидроксиалкилкрахмала имеет молекулярную массу примерно 130 кДа.9. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что молекула гидроксиалкилкрахмала имеет степень замещения от примерно 0,3 до примерно 0,7.10. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что молекула гидроксиалкилкрахмала имеет соотношение С₂-замещения к С₆-замещению от 8 до 12.11. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что молекулой гидроксиалкилкрахмала является молекула гидроксиэтилкрахмала.12. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что низкомолекулярным веществом является лекарственное биологически активное вещество.13. Конъюгат по п.12, отличающийся тем, что лекарственное биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, антидепрессивных средств, антидиабетических средств, антидиуретиков, антихолинергических средств, антиаритмических средств, противорвотных средств, антиэпилептических средств, противогистаминных средств, противогрибковых средств, противосимпатотонических средств, антитромботических средств, андрогенов, антиандрогенов, эстрогенов, антиэстрогенов, средств против остеопороза, противоопухолевых средств, вазодилататоров и других, снижающих кровяное давление средств, уменьшающих лихорадку средств, анальгетиков, подавляющих воспаление средств, β-блокаторов, иммуносупрессоров и витаминов.14. Конъюгат по п.12 или 13, отличающийся тем, что участвующей в реакции связывания функциональной группой лекарственного биологически активного вещества является аминогруппа.15. Конъюгат по п.14, отличающийся тем, что лекарственное биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из албутерола, алендроната, амиказина, аминопенициллина, амоксициллина, атенолола, азатиоприна, цефаклора, цефадроксила, цефотаксима, цефтазидима, цефтриаксона, циластатина, циметидина, ципрофлоксацина, клонидина, колистина, косинтропина, циклосерина, даунорубицина, доксорубицина, десмопрессина, дигидроэрготамина, добутамина, допамина, эфедрина, эпинефрина, е-аминокапроновой кислоты, эргометрина, эсмолола, фамотидина, флекаинида, фолевой кислоты, флуцитозина, фуросемида, ганцикловира, гентамицина, глюкагона, гидразалина, имипенема, изопротеренола, кетамина, лиотиронина, лутилиберина, мерпатрицина, метараминола, метилдопа, метоклопрамида, метопролола, мексилетина, митомицина, неомицина, нетилмицина, нимодипина, нистатина, октреотида, окситоцина, памидроната, пентамидина, фентоламина, фенилэфрина, прокаинамида, прокаина, пропранолола, ритодрина, соталола, теикопланина, тербуталина, тиамина, тилудроната, толазолина, триметоприма, трометамина, ванкомицина, вазопрессина и винбластина.16. Конъюгат по п.12 или 13, отличающийся тем, что участвующей в реакции связывания функциональной группой лекарственного биологически активного вещества является карбоксильная группа или активированная карбоксильная группа.17. Конъюгат по п.16, отличающийся тем, что лекарственное биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из ацетилцистеина, азлоциллина, азтреонама, бензилпенициллина, камптотецина, цефамандола, цефазолина, цефепима, цефотаксима, цефотетана, цефокситина, цефтазидима, цефтриаксона, цефалотина, циластатина, ципрофлоксацина, клавулановой кислоты, диклоксациллина, е-аминокапроновой кислоты, флоксациллина, формилтетрагидрофолиевой кислоты, фуросемида, фузидиевой кислоты, имипемема, индометацина, кеторолака, лиотиронина, мелфалана, метилдопа, пиперациллина, простациклина, простагландиныа, теикопланина, тикарциллина и ванкомицина.18. Конъюгат по п.12 или 13, отличающийся тем, что участвующей в реакции связывания функциональной группой лекарственного биологически активного вещества является алифатическая или арил-ОН-группа.19. Конъюгат по п.18, отличающийся тем, что лекарственное биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из албутерола, аллопуринола, апоморфина, цефтриаксона, добутамина, допамина, доксициклина, эдрофониума, изопротеренола, лиотиронина, метараминола, метилдопа, миноциклина, палцитаксела, пентазоцина, фенилэфрина, фентоламина, пропофола, рифамицина, ритодрина, таксола, теикопланина, тербуталина, тетрациклина и ванкомицина.20. Способ получения конъюгата гидроксиалкилкрахмала по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что осуществляют реакцию связывания между концевой альдегидной группой или карбоксильной группой, образующейся за счет селективного окисления концевой альдегидной группы, или активированной карбоксильной группой, полученной превращением указанной карбоксильной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала и функциональной группой низкомолекулярного вещества, выбранной из группы, состоящей из аминогруппы, карбоксильной группы, тиоловой группы и гидроксильной группы, которая является реакционноспособной по отношению к этой альдегидной группе или карбоксильной группе или происходящей от нее активированной карбоксильной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, и при этом связь, образующуюся непосредственно при реакции связывания, в случае необходимости модифицируют за счет дальнейшей реакции.21. Способ по п.20, отличающийся тем, что концевую альдегидную группу молекулы гидроксиалкилкрахмала путем селективного окисления превращают в соответствующую лактоновую группу и затем вводят во взаимодействие с первичной аминогруппой низкомолекулярного вещества, так что молекула гидроксиалкилкрахмала через амидную связь связывается с низкомолекулярным веществом.22. Способ по п.21, отличающийся тем, что селективное окисление альдегидной группы осуществляют с помощью иода или ионов металлов в водном щелочном растворе.23. Способ по п.21, отличающийся тем, что реакцию связывания осуществляют в присутствии карбодиимида, предпочтительно 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDC).24. Способ по п.20, отличающийся тем, что реакцию связывания осуществляют в гетерогенной фазе.25. Способ по п.20, отличающийся тем, что реакцию связывания осуществляют в гомогенной фазе в диметилсульфоксиде или N-метилпирролидоне или гликоле.26. Способ по п.21, отличающийся тем, что реакцию связывания осуществляют в диметилсульфоксиде или N-метилпирролидоне или гликоле в отсутствие активатора.27. Способ по п.20, отличающийся тем, что концевую альдегидную группу молекулы гидроксиалкилкрахмала связывают с первичной аминогруппой низкомолекулярного вещества с образованием основания Шиффа и образовавшееся основание Шиффа восстанавливают до амина, так что молекула гидроксиэтилкрахмала за счет аминной связи связывается с низкомолекулярным веществом.28. Способ по п.27, отличающийся тем, что восстановителем является боргидрид натрия, цианоборгидрид натрия или органический комплекс бора.29. Способ получения селективно окисленного по концевой альдегидной группе гидроксиалкилкрахмала, отличающийся тем, что гидроксиалкилкрахмал подвергают превращению в водном щелочном растворе при молярном соотношении иода к гидроксиалкилкрахмалу от 2:1 до 20:1.30. Способ по п.29, отличающийся тем, что молярное соотношение иода к гидроксиалкилкрахмалу составляет от примерно 5:1 до 6:1.31. Способ по п.29, отличающийся тем, что

a) количество гидроксиалкилкрахмала растворяют в горячей дистиллированной воде и добавляют немного меньше, чем 1 моль-эквивалент, водного раствора иода;

b) к реакционному раствору добавляют медленно, по каплям, с интервалом в несколько минут раствор NaOH в молярной концентрации, которая примерно 5-15-кратна таковой раствора иода, до тех пор, пока после добавления раствор начинает становиться снова прозрачным;

c) к реакционному раствору снова добавляют менее, чем 1 моль-эквивалент, водного раствора иода;

d) снова начинают прикапывание раствора NaOH;

e) стадии от b) до d) повторяют до тех пор, пока не добавят примерно 5,5-6 моль-эквивалентов раствора иода и 11-12 моль-эквивалентов раствора NaOH по отношению к гидроксиалкилкрахмалу;

f) затем реакцию прекращают и реакционный раствор обессоливают и подвергают катионообменной хроматографии и продукт реакции получают путем лиофилизации.