АППАРАТ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА МИТОХОНДРИЯМИ ИЛИ КЛЕТКАМИ Российский патент 2004 года по МПК C12M1/34 

Изобретение относится к области биохимии и биофизики. Аппарат предназначен для исследования сложных медико-биологических явлений в суспензии митохондрий или клеток. Он позволяет регистрировать функциональные изменения четырех параметров в исследуемом препарате: потребления кислорода, мембранного потенциала, транспорта ионов кальция и набухания. Измерения производятся в реальном времени с возможностью их компьютерной обработки, анализа и сохранения результатов.

Известен аппарат для регистрации потребления кислорода митохондриями или клетками, включающий термостатируемую ячейку с выполненной внутри кюветой для размещения в ней исследуемого образца, снабженную пробкой с отверстием для внесения проб и реагентов, датчик потребления кислорода и электронный модуль для передачи сигналов с датчика на компьютер (Сatalog Strathkelvin Instruments, Glasgo, UK, 1999). В ячейке и кювете имеется по одному отверстию, которые соединены между собой стеклянной трубкой, образуя полый цилиндрический канал под углом в 30^o к горизонтальной плоскости. Данный канал служит для фиксирования положения датчика потребления кислорода в кювете. Герметичность кюветы достигается за счет использования резиновых уплотнительных колец между датчиком и стенками направляющего канала. Управление датчиком осуществляется программно при помощи персонального компьютера через электронный модуль. Выходной сигнал датчика регистрируется компьютером. Программное обеспечение позволяет производить запись и хранение полученной информации в виде текстовых файлов.

Данный аппарат не пригоден для его использования в случаях, когда возникает необходимость в получении дополнительной информации об изменениях других параметров, одновременно происходящих с потреблением кислорода, в исследуемом образце. Для реализации данной цели встает необходимость в проведении параллельных экспериментов с использованием иного оборудования и других методов, что приводит к многократному увеличению расхода, как исследуемого образца, так и дорогостоящих реактивов и рабочего времени. При проведении параллельных экспериментов сложным оказывается соблюдение идентичности условий, что в результате приводит к проблематичности адекватного сравнения полученных результатов. Специфика материала, из которого выполнена ячейка и ее конструкция не позволяют произвести в ней регистрацию нескольких параметров. Необходимость применения резиновых уплотнительных колец для герметизации помещаемого в кювету датчика также является негативным фактором в виде того, что, как правило, материалы, из которых сделаны такие кольца, являются сильными сорбентами широко используемых в медико-биологических исследованиях органических реагентов, которые даже в следовых количествах способны вызывать артефактные реакции в исследуемой пробе.

Технический результат изобретения заключается в увеличении количества измеряемых параметров митохондрий или клеток и получении, таким образом, более точной информации в процессе медико-биологических исследований, касающихся воздействия на изучаемый объект токсических веществ, лекарств и других агентов.

Этот результат достигается тем, что в предложенном аппарате для регистрации потребления кислорода митохондриями или клетками, включающем термостатируемую ячейку с выполненной внутри кюветой для размещения в ней исследуемого образца, снабженной пробкой с отверстием для внесения проб и реагентов, датчик потребления кислорода и электронный модуль для передачи сигналов с датчика на компьютер, термостатируемая ячейка снабжена датчиками, позволяющими регистрировать дополнительно мембранный потенциал, концентрацию ионов кальция и набухание.

Кювета выполнена в виде шестигранной призмы. Датчики имеют форму усеченного конуса и расположены горизонтально в отверстиях стенки ячейки перпендикулярно граням кюветы.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 схематично изображен продольный разрез аппарата (компьютер не изображен); на фиг.2 - разрез по А-А фиг.1.

Аппарат состоит из корпуса 1, разделенного на два отсека. В нижнем отсеке 2 размещен электронный модуль 3, в верхнем отсеке 4 расположена термостатируемая ячейка 5. Внутри термостатируемой ячейки 5 выполнена кювета 6 в виде шестигранной призмы объемом 1 мл, которая служит для размещения в ней исследуемого образца. Перемешивание содержимого кюветы 6 осуществляется в непрерывном режиме при помощи магнитной мешалки 7. Термостатируемая ячейка 5 снабжена пробкой 8 с отверстием для внесения проб и реагентов и шестью датчиками 9, имеющими форму усеченного конуса и расположенными горизонтально в отверстиях стенки этой ячейки и перпендикулярно граням кюветы 6. Корпус 1 закрывается большой 10 и малой 11 съемными крышками.

Корпус 1 и крышки 10, 11 выполнены из металла. Они служат не только для защиты всей системы от электрических наводок, но также и для защиты датчиков системы от внешних источников света. Термостатируемая ячейка 5 изготовлена из оргстекла. За счет того, что датчики 9 имеют форму усеченного конуса, а отверстия в термостатируемой ячейке - соответствующую им по размеру форму, обеспечивается их долговременная и надежная фиксация, не требующая резьбовых соединений. Это исключает необходимость применения резиновых уплотнительных колец. Торец каждого датчика 9 образует с плоскостями граней кюветы 6 единую поверхность. Это исключает возможность наличия неровностей во внутреннем объеме кюветы 6, что в свою очередь значительно облегчает удаление отработанной пробы, промывание кюветы и снижает риск загрязнения кюветы между экспериментами.

В качестве датчика используются: для измерения потребления кислорода - полярографический закрытый электрод 12 (типа Кларка); для регистрации митохондиального или клеточного мембранного потенциала-тетрафенилфосфоний-селективный (ТРР⁺) электрод 13; для регистрации митохондриального или клеточного транспорта ионов кальция - кальций-селективный (Са²⁺) электрод 14; для регистрации набухания митохондрий или клеток - пара оптических сенсоров: светодиод 15 и фотодиод 16. В качестве электрода сравнения для ТРР⁺ и Са²⁺ электродов используется хлорсеребряный (Аg/AgCl) электрод 17
Аппарат работает следующим образом.

Задается температура термостатирования (например, 37^oС) и включается термостат. В кювету 6 вносится экспериментальный буферный раствор. Включаются датчики 9 и магнитная мешалка 7. Кювета закрывается пробкой 8. Запускается компьютерная программа, управляющая работой аппарата. В течение 1-2 минут регистрируются показания "базовой линии буфера" для каждого из параметров. Через отверстие в пробке 8 пипеткой вводится препарат митохондрий из расчета 1 мг/мл белка. Показания всех параметров системы мгновенно меняются и необходимо подождать 1,5-2,0 мин до выхода системы в состояние стабильности. Добавки исследуемых реагентов рекомендуется осуществлять не ранее 3-4 мин после внесения митохондрий в кювету 6. Так, добавление к митохондриям разобщителя динитрофенола приводит к линейно ускоренному потреблению кислорода, полному выбросу из них Са²⁺, полному падению мембранного потенциала и стимуляции набухания. По полученным данным можно определить, например, какова была последовательность развития событий в данном эксперименте. Для этого данные посредством математических трансформаций переводятся в форму калиброванных единиц и далее в форму первой производной и помещаются в единые временные координаты. Прямое сравнение пиков, отражающих максимальное приращение скорости процессов, показывает, что порядок ответа митохондриальных систем на действие разобщителя оказывается следующим: почти мгновенное ускорение дыхания и практически одновременно с ним падение мембранного потенциала и только затем с некоторым запаздыванием активируется выброс Са²⁺ и стимулируется набухание митохондрий.

Таким образом предложенный аппарат обеспечивает большее количество измеряемых параметров митохондрий или клеток, чем известный аппарат, таким образом имеется возможность получения более точной информации при исследовании воздействия на изучаемый объект токсических веществ, лекарств и других агентов.

Изобретение относится к биохимии и биофизике и предназначено для исследования сложных медико-биологических явлений в суспензии митохондрий или клеток. Аппарат содержит термостатируемую ячейку, внутри которой выполнена кювета в виде шестигранной призмы, снабженная пробкой с отверстием для внесения проб и реагентов, датчик потребления кислорода и электронный модуль для передачи сигналов с датчика на компьютер. Термостатируемая ячейка также снабжена датчиками, позволяющими регистрировать дополнительно мембранный потенциал, концентрацию ионов кальция и набухание. Датчики имеют форму усеченного конуса и расположены горизонтально в отверстиях стенки ячейки перпендикулярно граням кюветы. Изобретение обеспечивает увеличение количества измеряемых параметров митохондрий или клеток, получения более точной информации в процессе медико-биологических исследований. 2 ил.

Аппарат для регистрации потребления кислорода митохондриями или клетками, включающий термостатируемую ячейку с выполненной внутри кюветой для размещения в ней исследуемого образца, снабженную пробкой с отверстием для внесения проб и реагентов, датчик потребления кислорода и электронный модуль для передачи сигналов с датчика на компьютер, отличающийся тем, что термостатируемая ячейка снабжена датчиками, позволяющими регистрировать дополнительно мембранный потенциал, концентрацию ионов кальция и набухание, кювета, выполнена в виде шестигранной призмы, при этом датчики имеют форму усеченного конуса и расположены горизонтально в отверстиях стенки ячейки перпендикулярно граням кюветы.