СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТРОМБОФИЛИИ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ ВЫСОКОЙ АКТИВНОСТЬЮ КОАГУЛЯЦИОННОГО ФАКТОРА VIII Российский патент 2004 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности, исследованию крови и может быть использовано для лабораторной диагностики тромбофилии, обусловленной высокой активностью коагуляционного фактора VIII (FVIII).

Известен способ диагностики тромбофилии путем определения уровня FVIII иммунологическим методом [Moritz В., Brox С., Turecek P.L. et all. Characteristics of a novel assay for the determination of FVIII antigen. Immunozym F VIII:.Ag. // Annals of Hematology. - Supplement II to Vol.74. Abstracts 41th Annual Meeting of the GTH, 1997, Abstr. 232]. К недостаткам известного способа следует отнести высокую трудоемкость при его осуществлении, необходимость оснащения клинической лаборатории специальным дорогостоящим оборудованием для выполнения иммуноферментного анализа и потребность в реагентах зарубежного производства.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототип) является коагуляционный способ определения уровня FVIII [Унифицированная методика одностадийного количественного определения факторов VIII и IX. Гематология и трансфузиология, 1991, №4, с.33-35].

Способ-прототип осуществляют следующим образом.

Предварительно получают бедную тромбоцитами плазму крови (БТП) исследуемого больного.

Этап 1. Разведение контрольной плазмы крови для получения пяти калибровочных образцов, необходимых для построения калибровочной кривой, выполняют по схеме, представленной в табл. №1. Затем исследуют каолин-кефалиновое время свертывания смеси разведенных калибровочных образцов и плазмы дефицитной по FVIII.

Этап 2. Построение калибровочной кривой. Для построения калибровочного графика зависимости времени свертывания от активности FVIII используют полулогарифмическую систему координат и данные, полученные при выполнении первого этапа.

Этап 3. Исследуемую БТП разводят буфером Михаэлиса в соотношении 1:10. Затем исследуют каолин-кефалиновое время свертывания смеси разведенной БТП исследуемого больного и плазмы дефицитной по FVIII (в дефицитной по VIII фактору плазме есть все другие факторы, необходимые для коагуляции в достаточной концентрации, поэтому время свертывания в такой тест-системе зависит только от уровня FVIII).

Этап 4. Активность FVIII, определяемой при помощи калибровочной кривой.

Существенным недостатком известного способа является то, что при такой системе разведении возможно определить активность FVIII в исследуемой плазме лишь в диапазоне значений от 6,25 до 100%. Поэтому для определения активности FVIII более 100% в способе-прототипе необходимо выполнить дополнительный этап.

Дополнительный этап в способе-прототипе необходим для определения повышенной активности FVIII. Если активность FVIII превышает 100% для определения уровня FVIII возможно применить один из двух вариантов: 1) сделать дополнительное калибровочное разведение 1:5, соответствующее активности FVIII 200%, исследовать каолин-кефалиновое время свертывания смеси дополнительного калибровочного разведения 1:5 и плазмы дефицитной по FVIII, затем определить уровень FVIII по калибровочной кривой (однако, так называемая “цена секунды” в этом случае велика, что значимо снижает точность определения, так как снижается чувствительность тест-системы к уровню исследуемого фактора, а для определения активности FVIII более 200% необходимы дополнительное разведение и исследование исследуемой плазмы); 2) сделать дополнительное разведение исследуемой плазмы 1:20, исследовать каолин-кефалиновое время свертывания смеси разведения исследуемой плазмы 1:20 и плазмы дефицитной по FVIII, затем определить активность FVIII по калибровочной кривой, а полученный результат умножить на 2. Однако, если активность FVIII больше 200% следует выполнить дополнительное разведение 1:40 и затем исследовать каолин-кефалиновое время свертывания смеси разведения исследуемой плазмы 1:40 и плазмы дефицитной по FVIII. После этого следует определить активность FVIII по калибровочной кривой, а полученный результат умножить на 4.

Таким образом, к существенным недостаткам способа-прототипа следует отнести сложную систему построения калибровочной кривой, большой расход реагентов, необходимость выполнения дополнительного этапа для определения высокой активности фактора VIII, а также необходимость больших временных затрат на его выполнение.

Авторы предлагают простой способ, основанный на сравнении времени свертывания в АПТВ-тесте различно разведенных исследуемой и контрольных плазм. В предлагаемом способе определяют время свертывания в АПТВ-тесте контрольной плазмы только лишь в одном разведении трис-буфером в соотношении 1:20 (большее разведение повышает чувствительность тест-системы к уровню исследуемого фактора VIII) и время свертывания в АПТВ-тесте исследуемой плазмы в разведении 1:30. Таким образом, при активности FVIII 100% в контрольной плазме время свертывания в исследуемой будет короче, чем в контрольной только лишь в том случае, если активность FVIII будет более 150%; время свертывания в исследуемой будет длиннее, чем в контрольной только лишь в том случае, если активность FVIII будет менее 150% (так как разведения исследуемой и контрольной БТП отличаются в 1,5 раза). Разные разведения исследуемой и контрольной плазмы позволяют диагностировать тромбофилию, обусловленную высокой активностью фактора VIII, в АПТВ-тесте без этапа построения калибровочной кривой. При этом значительно снижен расход реагентов, отсутствует необходимость выполнения каких-либо дополнительных этапов, значимо сокращено время исследования.

Положительным результатом заявленного способа является упрощение и сокращение времени исследования. Положительный результат достигается тем, что определяют время свертывания в двух разведениях: 1:20 для контрольной плазмы и 1:30 для исследуемой плазмы и при значении показателя соотношения более 1,0 диагностируют тромбофилию, обусловленную высокой активностью фактора VIII.

Способ осуществляют следующим образом:

Реактивы и оборудование:

1) 3,8% (0,1 М) раствор цитрата натрия. Получают растворением 3,8 г тринатрия-цитрата в 100 мл дистиллированной воды;

2) Трис-HCl буфер, рН 7,4 (производитель "Технология-Стандарт", Россия);

3) АПТВ-Эл-тест, (АПТВ-реагент, лиофильно высушенная смесь элаговой кислоты и фосфолипидов, производитель "Технология-Стандарт", Россия);

4) STS-standard-plasma (лиофильно высушенная контрольная нормальная плазма с аттестованным по активности FVIII значением, производитель "Dade-Behring", Германия);

5) Дефицитная по фактору VIII плазма, лиофильно высушенная, (производитель "Технология-Стандарт", Россия);

6) Хлорид кальция 0,025 М раствор, (производитель "Технология-Стандарт", Россия);

7) Центрифуга ОПН-8, (Россия).

Приготовление реагентов и образцов плазмы для исследования:

Подготовка исследуемой БТП больного

Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0,1 М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 мин при скорости вращения 1000 об/мин (200 g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 мин при скорости 3500 об/мин (1200 g). Полученную БТП разводят Трис-НСl буфером в соотношении 1:30. Такое разведение используют для проведения исследования.

Подготовка контрольной плазмы

Во флакон STS-standard-plasma с активностью FVIII 100% добавить 1,0 мл дистиллированной воды, перемешать без встряхивания, выдержать при комнатной температуре (18...20°С) в течение 10 мин, затем развести в соотношении 1:20. Такое разведение используют для проведения исследования.

Подготовка дефицитной по фактору VIII плазмы

Во флакон с дефицитной по фактору VIII плазмой с активностью FVIII менее 1% добавить 1,0 мл дистиллированной воды, перемешать без встряхивания, выдержать при комнатной температуре (18...20°С) в течение 10 мин. Разведенную дефицитную по фактору VIII плазму используют для проведения исследования.

Разведение АПТВ-реагента

Во флакон АПТВ-Эл-тест добавить 2,5 мл дистиллированной воды, перемешать без встряхивания, выдержать при комнатной температуре (18...20°С) в течение 10 мин.

Ход определения:

1) В первую пробирку с 0,1 мл разведенной контрольной плазмы, добавляют 0,1 мл дефицитной по фактору VIII плазмы, 0,1 мл АПТВ реагента, инкубируют смесь на водяной бане 3 мин при температуре 37°С, после чего к ней добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция. Регистрируют время свертывания (t₁) при непрерывном помешивании.

2) Во вторую пробирку с 0,1 мл разведенной исследуемой плазмой добавляют 0,1 мл дефицитной по фактору VIII плазмы, 0,1 мл АПТВ реагента, инкубируют смесь на водяной бане 3 мин при температуре 37°С, после чего к ней добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция. Регистрируют время свертывания при непрерывном помешивании (t₂).

Оценка полученных результатов

Для диагностики тромбофилии, обусловленной высокой активностью FVIII вычисляют отношение по формуле

где соотношение - отношение времени свертывания в тесте АПТВ различно разведенных исследуемой и контрольной БТП;

t₁ - время свертывания в АПТВ-тесте смеси разведенной 1:20 контрольной плазмы и дефицитной по FVIII плазмы;

t₂ - время свертывания в АПТВ-тесте смеси разведенной 1:30 исследуемой и дефицитной по FVIII плазмы.

Если показатель соотношение больше 1,0, то диагностируют тромбофилию, обусловленную высокой активностью коагуляционного фактора VIII, так как при активности FVIII более 150% время свертывания исследуемой плазмы (t₂) короче, чем время свертывания контрольной плазмы (t₁).

Специфичность и воспроизводимость способа

Заявляемый способ диагностики тромбофилии высоко специфичен, его показания зависят только от уровня коагуляционного фактора VIII и на его показания не оказывают влияния другие дефекты системы гемостаза, вызывающие тромботические нарушения, поскольку в тест-системе применяется плазма дефицитная только по фактору VIII, a уровень всех других факторов свертывания и антикоагулянтов в этой плазме нормальный.

Для оценки воспроизводимости способа использовали определение коэффициента вариации (в %) при многократном исследовании одних и тех же образцов нормальной плазмы и плазмы больных с высоким уровнем фактора VIII в разные дни. Заявляемый способ показал хорошую воспроизводимость. Коэффициент вариации не превышал 6%.

Клиническая апробация предлагаемого способа

Для апробации предлагаемого способа диагностики тромбофилии, обусловленной высокой активностью фактора VIII было обследовано 112 больных с тромботическими нарушениями в возрасте от 17 до 45 лет. Для диагностики тромбофилии, обусловленной высокой активностью коагуляционного фактора VIII, выполняли иммунологический способ для определения уровня FVIII, способ прототип и предлагаемый способ. Кроме того, выполняли другие лабораторные методы для выявления дефектов системы гемостаза, вызывающих тромботические нарушения. Из числа обследованных больных тромбофилия, обусловленная высокой активностью фактора VIII, выявлена у 11 больных (см. табл. №2). При этом, способ-прототип и заявляемый способ выявили тромбофилию, обусловленную высокой активностью фактора VIII у одних и тех же 11 больных.

Примеры практического использования способа

Клинический пример №1.

Больной №1, 48 лет, илеофеморальный тромбоз слева развился в ноябре 2001 года. Был госпитализирован в отделение сосудистой хирургии Алтайской краевой клинической больницы 12.11.2001. Жалобы на боли в левой нижней конечности в покое и при ходьбе, отечность левой голени. Тромбозы у данного больного с 39-летнего возраста, три раза была тромбоэмболия легочной артерии (в возрасте 39 лет, в возрасте 40 лет и в возрасте 43 года). Была проведена имплантация кавального фильтра в нижнюю полую вену, чрезкожным доступом на уровне Л₂-Л₃ в 1996 году. На момент осмотра общее состояние удовлетворительное, частота дыхания 16 в 1 мин, число сердечных сокращений 88 в мин. Артериальное давление 130/80. Левая нижняя конечность отечна (окружность на уровне нижней трети бедра слева на 5 см больше аналогичного размера справа), ее цвет изменен (имеет вишневый оттенок). По данным эхо-доплерографии выявлено нарушение тока крови на уровне илеофеморального сегмента слева. Проведено исследование системы гемостаза для исключения тромбофилии, обусловленной высокой активностью фактора VIII (см. табл. №3). На основании жалоб, анамнестических, физикальных, инструментальных и лабораторных данных, установлен диагноз: тромбофилия, обусловленная высокой активностью коагуляционного фактора VIII, осложнение: острый илеофеморальный тромбоз слева. Состояние после рецидивирующей ТЭЛА (1992, 1993, 1996).

В этом клиническом примере, используя предложенный метод, была распознана тромбофилия, обусловленная высокой активностью фактора VIII, т.к показатель соотношения более 1,0 (1,12).

Клинический пример №2.

Больной №2, 40 лет, илеофеморальный тромбоз слева развился в марте 2000 года. Был госпитализирован в отделение сосудистой хирургии Алтайской краевой клинической больницы 7.03.2000. Жалобы на боли в левом бедре и левой подвздошной области, отечность левого бедра, голени и стопы.

Тромботические нарушения с 38-летнего возраста. В марте 1998 возник острый тромбоз поверхностных вен правого бедра. Был госпитализирован в хирургическое отделение центральной районной больницы, где лечился в течение трех недель. В середине января 1999 развились тромбоз глубоких вен левой голени и тромбоэмболия легочной артерии. Лечение проводилось в отделении сосудистой хирургии Алтайской краевой клинической больницы. Имеет инвалидность с августа 1999 года. В этиологии этого тромботического заболевания имеет значение наследственность. Инфаркт миокарда у старшего брата развился в возрасте 47 лет. Мать умерла от тромбоэмболии легочной артерии в 55-летнем возрасте. Сестра умерла в 25-летнем возрасте внезапно. В 1999 году в лаборатории патологии гемостаза диагностировали наследственную тромбофилию вследствие резистентности фактора V к активированному протеин С.

На момент осмотра общее состояние удовлетворительное, частота дыхания 18 в 1 мин, число сердечных сокращений 98 в мин. Артериальное давление 120/80. Левая нижняя конечность отечна (окружность на уровне нижней трети бедра слева на 9 см больше аналогичного размера справа), ее цвет не изменен. По данным эхо-доплерографии выявлено нарушение тока крови на уровне илео-феморального сегмента слева. Проведено исследование системы гемостаза для исключения тромбофилии, обусловленной высокой активностью фактора VIII (см. табл. №4). На основании жалоб, анамнестических, физикальных, инструментальных и лабораторных данных, установлен диагноз: Тромбофилия, обусловленная резистентностью фактора V к активированному протеину С. Осложнение: Острый илеофеморальный тромбоз слева. Состояние после ТЭЛА (1999).

В этом клиническом примере, используя предложенный метод, была исключена тромбофилия, обусловленная высокой активность фактора VIII, т.к показатель соотношения менее 1,0 (0,95).

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики тромбофилии, обусловленной высокой активностью коагуляционного фактора VIII. Заявленный способ заключается в том, что определяют время свертывания в двух разведениях: 1:20 для контрольной плазмы и 1:30 для исследуемой плазмы и при значении показателя соотношения более 1,0 диагностируют тромбофилию, обусловленную высокой активностью фактора VIII. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа и сокращении времени исследования. 4 табл.

Способ диагностики тромбофилии, обусловленной высокой активностью коагуляционного фактора VIII, путем определения активированного парциального тромбопластинового времени свертывания смеси дефицитной по фактору VIII плазмы и исследуемой плазмы крови, отличающийся тем, что определяют время свертывания в двух разведениях: 1:20 для контрольной плазмы и 1:30 для исследуемой плазмы и при значении показателя соотношения более 1,0 диагностируют тромбофилию, обусловленную высокой активностью фактора VIII.