СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/49 G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики антифосфолипидного синдрома.

Известно, что антифосфолипидный синдром (АФС) является частой причиной рецидивирующих тромбозов, тромбоэмболий, инфарктов, нарушений мозгового кровообращения и других тромботических нарушений. Сущность его патогенеза заключается в появлении в крови антител к отрицательно заряженным фосфолипидам и белково-фосфолипидным комплексам. К этой группе антител относится "волчаночный антикоагулянт" (ВА), впервые идентифицированный и описанный Conley C. L. и соавт. в 1952 г. Он появляется в крови при многих иммунных заболеваниях и синдромах. Известны случаи обнаружения ВА у больных без четких проявлений каких-либо других заболеваний. Появление ВА в крови ухудшает течение предшествующего заболевания, часто приводит к развитию тромботических осложнений и является одной из причин невынашивания беременности. Поэтому быстрая и точная диагностика АФС является актуальной задачей. При этом поиск надежных методов его диагностики связан со значительными трудностями, обусловленными неоднородностью этой группы антител, а также тем, что нередко диагностировать его приходится на фоне гепаринотерапии.

Известен способ диагностики АФС путем определения в крови антител к отрицательно заряженным фосфолипидам (иммуноглобулинов G, М и А, в том числе антикардиолипиновых) (Harris E.N., Gharavi A.E., Patel S.A., Hughes G.R.V. Evaluation of the anti-cardiolipin test: report of an international workshop held 4 April 1986. //Clin. Exp.Immunol.-1987. - 68. - P. 215-22).

Недостатком известного способа является низкая специфичность, поскольку он не выявляет ВА, а только определяет состояние иммунной системы, при которой возможно присутствие в крови этого антикоагулянта. Известный способ трудоемкий, часто дает ложноположительные результаты анализа, требует специального оборудования для иммуноферментного анализа и дорогостоящих импортных реагентов.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототип) является способ диагностики АФС по патенту 2104550 от 10.02.98 г., Россия. Приоритет от 24.05.95 г. (Способ диагностики антифосфолипидного синдрома).

Способ-прототип осуществляют следующим образом.

Предварительно получают бедную тромбоцитами контрольную нормальную плазму и бедную тромбоцитами плазму (БТП) больного.

Этап 1. Параллельно на образцах контрольной нормальной плазмы и БТП больного выполняют ориентировочные фосфолипид-зависимые коагуляционные тесты.

Этап 2. При выявлении гипокоагуляции в каком-либо ориентировочном тесте выполняют первый коррекционный тест. Для этого в качестве исследуемого образца плазмы используют смесь БТП больного и контрольной нормальной плазмы в соотношении 4:1. Устранение гипокоагуляции в смеси с контрольной нормальной плазмой исключает наличие в плазме ВА.

Этап 3. При отсутствии коррекции гипокоагуляции в тесте смешивания с контрольной нормальной плазмой выполняют второй коррекционный тест, где БТП больного смешивают с 3% раствором эритрофосфатида. Если достигнута коррекция гипокоагуляции эритрофосфатидом, диагностируют АФС.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести:
1. Трудоемкость, многоэтапность и, связанную с этим, значительную затрату времени.

2. Невозможность количественной оценки полученных результатов.

3. Терапевтические концентрации гепарина в плазме крови (0,05-0,4 МЕ/мл) не позволяют диагностировать АФС, поскольку гепарин, как и ВА, вызывает гипокоагуляцию в фосфолипид-зависимых коагуляционных тестах.

Заявляемый способ лишен этих недостатков: выполняется в два этапа, что значительно сокращает время исследования, дает количественное выражение результатов и может выполняться на фоне гепаринотерапии.

Авторами разработан высокоэффективный способ диагностики антифосфолипидного синдрома, позволяющий распознавать АФС на основе определения времени свертывания с двумя АПТВ-реагентами: высокочувствительным и низкочувствительным к действию ВА.

Положительным результатом заявляемого изобретения является упрощение способа диагностики и повышение его эффективности за счет количественного определения оценки результатов исследования. Положительный результат достигается тем, что используют высокочувствительный и низкочувствительный к волчаночному антикоагулянту АПТВ-реагенты, вычисляют отношение индексов АПТВ и при значении отношения больше 1,3 диагностируют АФС.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование:
1. Цитрат натрия, трехзамещенный, 3,8% раствор, получают растворением 3,8 г трехзамещенного цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.

2. DiaCelin, фирма "DiaMed AG", Швейцария - АПТВ-реагент с высокой чувствительностью к ВА.

3. АПТВ-тест, фирма "Технология-Стандарт", Россия - АПТВ-реагент с низкой чувствительностью к ВА.

4. Кальция хлорид, 0,277% раствор, получают растворением 0,277 г CaCl₂ в 100 мл дистиллированной воды.

5. Центрифуга ОПН-8.

6. Коагулометр ВС 10, производитель АО "Мелт", Россия.

Подготовка исследуемой БТП больного и контрольной нормальной плазмы крови (у здоровых людей)
Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0,1 М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9: 1). Кровь центрифугируют 5 минут при скорости вращения 1000 об/мин (200 g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 минут при скорости 3500 об/мин (1200 g). Полученную БТП используют для проведения исследования.

Ход определения
Этап 1. Параллельно на образцах контрольной нормальной плазмы и БТП больного определяют время свертывания АПТВ-реагентом с высокой чувствительностью к ВА.

0,1 мл БТП смешивают с 0,1 мл АПТВ-реагента с высокой чувствительностью к ВА, инкубируют 3 мин в термостате коагулометра при +37^oС. Затем добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция. Коагулометр регистрирует свертывание (результат, полученный на образце плазмы больного, обозначают как t₁, а аналогичный результат анализа контрольной нормальной плазмы обозначают как t₂).

Этап 2. Параллельно на образцах контрольной нормальной плазмы и БТП больного исследуют время свертывания АПТВ-реагентом с низкой чувствительностью к ВА.

0,1 мл БТП смешивают с 0,1 мл АПТВ-реагента с низкой чувствительностью к ВА, инкубируют 3 мин в термостате коагулометра при +37^oС. Затем добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция. Коагулометр регистрирует свертывание (результат, полученный на образце плазмы больного, обозначают как t₃, а аналогичный результат исследования контрольной нормальной плазмы обозначают как t₄).

Вычисляют показатель NR по формулам:
R_x=t₁/t₂;
R_y=t₃/t₄;
NR= R_x/R_y,
где t₁ - время свертывания БТП больного с АПТВ-реагентом, обладающим высокой чувствительностью к ВА;
t₂ - время свертывания контрольной нормальной БТП с АПТВ-реагентом, обладающим высокой чувствительностью к ВА;
t₃ - время свертывания БТП больного с АПТВ-реагентом, обладающим низкой чувствительностью к ВА;
t₄ - время свертывания контрольной нормальной БТП с АПТВ-реагентом, обладающим низкой чувствительностью к ВА.

R_x - показатель удлинения времени свертывания у больного, в сравнении с контролем, в тесте с АПТВ-реагентом, обладающим высокой чувствительностью к ВА.

R_y - показатель удлинения времени свертывания у больного, в сравнении с контролем, в тесте с АПТВ-реагентом, обладающим низкой чувствительностью к ВА.

NR - нормализованное отношение, которое количественно оценивает гипокоагуляционный эффект ВА в АПТВ-тесте.

Оценка полученных результатов
При обследовании здоровых людей и больных без АФС установлено, что в среднем показатель NR был равен 1,01 (SD=0,145, m=0,17, n=78), а пределы нормальных колебаний (X±2SD) составили 0,71-1,29. Следовательно NR у здоровых людей и больных без АФС (в плазме крови которых отсутствует ВА) всегда меньше 1,3. В тех случаях, где NR равняется или превышает 1,3 диагностируют антифосфолипидный синдром.

Апробация предлагаемого способа
Апробацию заявляемого способа диагностики провели на 18 больных с АФС, который протекал на фоне системной красной волчанки (СКВ). Больные обследовались до назначения гепарина и на фоне проведения гепаринотерапии (5 тыс. ME, подкожно, 4-6 раз в сутки). Для клинико-лабораторной диагностики СКВ использовали принятые ревматологами критерии. У всех обследованных больных с АФС имелись лабораторные признаки ВА (удлинение времени свертывания в фосфолипид-зависимых коагуляционных тестах, отсутствие коррекции удлинения времени свертывания нормальной плазмой, наличие коррекции удлинения времени свертывания эритрофосфатидом).

Контрольные исследования были выполнены на группе здоровых людей (20 человек) и группе больных с СКВ, у которых отсутствовали признаки АФС (16 человек).

Из таблицы I видно, что NR у больных с АФС был достоверно выше аналогичного показателя в группе здоровых и больных без АФС. Отметим также, что показатель NR, был выше значения 1,3 у всех обследованных больных с АФС.

Диагностика АФС у больных, получающих гепарин
Известно, что основным клиническим проявлением АФС являются тромботические нарушения, и поэтому этим больным часто проводится гепаринотерапия. При этом терапевтическая концентрация гепарина в плазме крови составляет обычно 0,05-0,40 МЕ/мл. Заявляемый способ позволяет проводить диагностику АФС больным, которым проводится гепаринотерапия. Такая возможность имеется благодаря тому, что чувствительность к гепарину у обоих АПТВ-реагентов, применяемых в этом способе, примерно одинакова, но чувствительность к гипокоагуляционному действию ВА - разная. Для подтверждения возможности диагностики АФС на фоне гепаринотерапии мы провели исследование, результаты которого представлены в таблице II. Из таблицы следует, что на фоне гепаринотерапии показатель NR не изменяется.

Специфичность способа и его воспроизводимость
Таким образом, заявляемый способ отличается высокой специфичностью к гипокоагуляционному действию ВА. Другие причины, вызывающие гипокогуляцию в АПТВ-тесте, не оказывают влияния на показания заявляемого способа, так как параллельно определяются два АПТВ (с высокочувствительным и низкочувствительным к ВА АПТВ-реагентами). В частности, гепарин, дефицит факторов свертывания крови и их иммунные ингибиторы будут вызывать гипокоагуляцию в АПТВ-тесте как с высокочувствительным так и с низкочувствительным к ВА АПТВ-реагентами.

Для оценки воспроизводимости способа использовали коэффициент вариации CV (%). Коэффициент вариации этого теста при исследовании в разные дни не превышает 7%.

Пример практического использования предлагаемого способа.

Больная К. , 37 лет, поступила в ревматологическое отделение Алтайской краевой клинической больницы 22.11.98 г. с жалобами на повышение температуры до фебрильных цифр, боли в коленных, тазобедренных, плечевых суставах, наличие "бабочки" на лице, слабость, утомляемость. Больна в течение семи лет (состоит на "Д" учете по поводу СКВ). За время заболевания дважды отмечает тромботические осложнения: тромбоз вен голени справа в июне 1995 года и тромбоз левой бедренной артерии в августе 1997 года. Принимала преднизолон в дозе 15 мг/сут и нестероидные противовоспалительные препараты. Последнее ухудшение с начала ноября 1998 года проявляется вышеперечисленными жалобами. В анализах крови обнаружены умеренный лейкоцитоз, LE-клетки 10:1000, антитела к нативной ДНК 1/16, антитела к денатурированной ДНК 1/8, выявляются антитела (Ig G) к кардиолипину, ЦИК 40 уд. ед.

Проведена лабораторная диагностика АФС (см. табл.III).

На основании клинических и лабораторных данных сформулирован диагноз: Системная красная волчанка, хроническое течение, активность II, с поражением кожи и суставов. Антифосфолипидный синдром.

Через месяц после проведенного лечения состояние больной улучшилось, нет температуры, уменьшились артралгии. Больной вновь была проведена лабораторная диагностика АФС способом-прототипом и заявляемым способом (см. табл. III).

В приведенном клиническом примере иллюстрируется практическое значение заявляемого способа диагностики антифосфолипидного синдрома. Как следует из таблицы III, у больной качественные реакции, выявляющие ВА, положительны (каолиновое время, время свертывания с разведенным тромбопластином, лебетоксовый тест, тест коррекции с нормальной плазмой не выявляет коррекцию, тест коррекции с эритрофосфатидом устраняет гипокоагуляцию в тестах). На фоне гепаринотерапии также имеется гипокоагуляция, но при этом невозможно дифференцировать причину гипокоагуляции (ВА или терапевтические концентрации гепарина в плазме). Заявляемый способ диагностирует АФС и показывает стабильные результаты NR на фоне гепаринотерапии. После курса лечения у больной, как следует из таблицы IV, качественные реакции, выявляющие ВА, остаются положительными, степень удлинения времени свертывания в различных тестах - разная, поэтому, используя способ-прототип трудно объективно оценить эффективность применявшихся методов лечения, но заявляемый способ демонстрирует снижение показателя NR, что соответствует клиническому улучшению состояния. Таким образом, заявляемый способ позволяет объективно оценить эффективность применявшихся методов лечения.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике. Способ заключается в том, что используют высокочувствительный и низкочувствительный к волчаночному антикоагулянту АПТВ-реагенты, вычисляют отношение индексов АПТВ и при значении отношения больше 1,3 диагностируют антифосфолипидный синдром. Технический результат: способ обеспечивает повышение эффективности диагностики, количественное определение результатов исследования, возможность исследования на фоне гепаринотерапии. 4 табл.

Способ диагостики антифосфолипидного синдрома, включающий оценку времени свертывания исследуемой плазмы в фосфолипидзависимом тесте, отличающийся тем, что используют высокочувствительный и низкочувствительный к волчаночному антикоагулянту АПТВ-реагенты, вычисляют отношение индексов АПТВ и при значении отношения больше 1,3 диагностируют АФС.