СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к гематологии, а именно к лабораторньм способам определения скорости перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных.

Существует способ определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов, который основан на измерении содержания образующегося при окислении мембранных липидов малонового диальдегида (МДА) по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (Строев Е.М., Макарова В.Г. "Практикум по биологической химии": Учебное пособие для фармац. вузов и фак. -М: Высш. шк., 1986.-С.211-213). Указанный способ был взят в качестве прототипа.

Способ включает получение осадка эритроцитов путем центрифугирования образцов крови; 3-кратную промывку осадка эритроцитов физиологическим раствором хлористого натрия и переосаждение в том же режиме центрифугирования; проведение полного гемолиза эритроцитов путем добавления к 0,5 мл осадка эритроцитов равного объема дистиллированной воды и выдерживания в течение 30 мин; получение образцов мембран эритроцитов из гемолизированных эритроцитов с помощью центрифугирования и осторожного отбора пипеткой надосадочной жидкости с серой прослойкой мембран эритроцитов; подготовку трех опытных образцов: в первую пробирку вносят по 0,3 мл раствора соли Мора (4х10^-5 М свежеприготовленный раствор), трис-буфера (трис-НСl буфер, 0,04 М раствор с рН 7,4), аскорбиновой кислоты (2,6 мМ свежеприготовленный раствор) и 0,1 мл полученной взвеси мембран эритроцитов, во вторую пробирку приливают 0,3 мл трис-буфера, 0,6 мл дистиллированной воды и 0,1 мл взвеси мембран эритроцитов, в третью (контроль) добавляют те же реактивы, что и в первую пробирку, после чего сразу приливают 1 мл трихлоруксусной кислоты. Далее инкубируют образцы 20 мин в водяной бане при 37°С, останавливают реакцию, добавляя в обе опытные пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, все пробы центрифугируют, сливают надосадочную жидкость (2 мл), прибавляют по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещают образцы на 10 мин в кипящую водяную баню и охлаждают в ледяной воде. Измеряют величину оптической плотности полученных проб против контроля на спектрофотометре при длине волны 532 нм или фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см и рассчитывают скорость перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов по формулам

и ,

где X1 - скорость образования в пробе МДА в присуствии прооксидантов: соли Мора и аскорбиновой кислоты (индуцированное перекисное окисление липидов), нмоль в час; Х2 - скорость образования в пробе МДА в отсуствии прооксидантов (спонтанное перекисное окисление липидов), нмоль в час; 3 - объем пробы, мл; 6 - коэффициент пересчета на 1 час; 0,156 - экстинция 1 нмоля малонового диальдегида при 532 нм; Е1 и Е2 - оптическая плотность соответственно первой и второй проб против контроля.

Недостатком этого способа является то, что при его использовании для определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных отмечено появление осадка (взвеси) после взаимодействия находящихся в сливе веществ с тиобарбитуровой кислотой, что сказывается на результатах измерения оптической плотности. При этом отсутствует повторяемость результатов при анализе одной и той же пробы.

Задачей настоящего изобретения является подбор оптимального объема образцов мембран эритроцитов сельскохозяйственных животных, который может быть использован для инкубации, и уточнение условий проведения последующих этапов для выявления продуктов реакции перекисного окисления липидов, что в итоге позволит обеспечить повторяемость результатов определения продуктов реакции и повысить точность. В этом состоит технический результат.

Технический результат изобретения достигается за счет проведения водного гемолиза эритроцитов ледяной водой, уменьшения объема взвеси эритроцитов в опытных образцах (в 6,7 раза по сравнению с прототипом), использования горячей тиабарбитуровой кислоты для проведения цветной реакции и уточнения формулы расчета результата.

Способ осуществляется следующим образом:

- получают кровь из яремной вены животных с использованием антикоагулянта;

- кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, осаждая эритроциты;

- полученный осадок эритроцитов промывают 0,9% раствором хлористого натрия до исчезновения окраски в надосадочной жидкости и переосаждают в том же режиме центрифугирования;

- осуществляют полный гемолиз эритроцитов: в чистую центрифужную пробирку отбирают по 0,5 мл осадка эритроцитов и приливают из пипетки сильной струей равный объем охлажденной до 0°С дистиллированной воды и оставляют стоять в течение 30 мин;

- получают образцы мембран эритроцитов - пробы центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, осторожно отсасывают надосадочную жидкость с серой прослойкой мембран эритроцитов и переносят в чистую пробирку;

- осуществляют инкубацию образцов мембран эритроцитов - на каждый образец мембран готовят 3 пробирки: в первую пробирку вносят по 0,6 мл раствора соли Мора (4х10^-5 М свежеприготовленный раствор), аскорбиновой кислоты (2,6 мМ свежеприготовленный раствор), 0,77 мл трис-буфера (трис-НСl буфер, 0,04 М раствор с рН 7,4), и 0,03 мл полученной взвеси мембран эритроцитов; во вторую пробирку приливают 0,77 мл трис-буфера, 0,03 мл взвеси мембран эритроцитов и 1,2 мл дистиллированной воды; в третью (контроль) добавляют те же реактивы, что и в первую пробирку, после чего сразу приливают 2 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты; подготовленные пробы помещают в термостатат и инкубируют в течение 20 мин при 37°С;

- останавливают реакцию путем добавления в опытные пробирки по 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты;

- проводят подготовку содержимого проб для цветной реакции - все образцы центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, затем осторожно пипеткой с удлиненным концом отбирают надосадочную жидкость;

- осуществляют цветную реакцию: отмеряют по 3,0 мл полученной надосадочной жидкости в теплые пробирки, в каждую из которых прибавляют по 1,5 мл 0,8% свежеприготовленного горячего раствора тиобарбитуровой кислоты, и помещают пробы на 10 мин в кипящую водяную баню. После инкубации пробирки охлаждают в ледяной воде;

- измеряют величину оптической плотности опытных проб против контроля на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см и рассчитывают скорость образования конечного продукта перекидного окисления липидов - малонового диальдегида по формулам

и ,

где X1 - скорость образования в пробе МДА в присуствии прооксидантов - соли Мора и аскорбиновой кислоты (индуцированное перекисное окисление липидов), нмоль в час; Х2 - скорость образования в пробе МДА в отсуствии прооксидантов (спонтанное перекисное окисление липидов), нмоль в час; 4,0 - общий объем среды для инкубации полученных образцов мембран, мл; 3,0 - объем пробы для проведения цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой, мл; 4,5 - объем пробы, мл, взятый для фотометрирования; 6 - коэффициент пересчета на 1 час; 0,156 - экстанция 1 нмоль МДА при 532 нм; Е1 и Е2 - оптическая плотность соответственно первой и второй проб против контроля.

Эксперименты по определению скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных проводили на телочках двух-шестимесячного возраста фермы Выльгородской научно-экспериментальной станции Коми научного центра УрО РАН (г. Сыктывкар).

Пример 1. В ходе проведения экспериментов было отмечено, что содержимое проб после реакции тиобарбитуровой кислоты с продуктами, которые образовывались после инкубации пробы мембран эритроцитов телочек из расчета 0,1 мл на 1,0 мл инкубационной среды или 0,2 мл на 2,0 мл среды при 37°С в течение 20 мин, был мутным и содержал частички осадка. Появление осадка в пробе сказывалось на результатах анализа при фотометрировании. Поэтому было проведено исследование скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в образцах мембран эритроцитов у телочек в зависимости от изменения объема свежеполученных образцов мембран, взятого для проведения инкубации. Получили, что максимальная скорость образования продуктов перекисного окисления липидов или малонового диальдегида наблюдается при добавлении в инкубационную среду объемом 2,0 мл 0,03 мл препарата мембран эритроцитов (табл. 1).

Пример 2. В ходе проведения экспериментов доказана необходимость в проведении аккуратного отбора надосадочной жидкости после остановки реакции образования продуктов перекисного окисления липидов в образцах мембран эритроцитов животных добавлением в инкубационную среду 40% трихлоруксусной кислоты и их последующем центрифугировании в течение 15 мин. Отмечено, что после прохождения этой реакции на стенках пробирок появляется легкий сероватый налет, который при сливе содержимого из пробирок легко попадает в надосадочную жидкость. В связи с этим величины скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в 1,5-3,0 раза превышают показатели, полученные при аккуратном отборе проб (табл. 2).

Пример 3. При использовании способа, взятого в качестве прототипа для определения скорости образования продуктов реакций перекисного окисления липидов, отмечается разброс в величинах при параллельном исследовании одной пробы мембран (табл. 3, животные №№1 и 2). Предлагаемый нами способ обеспечивает оптимальную вероятность совпадения результатов, полученных при анализе одних и тех же образцов мембран эритроцитов у животных (табл. 3, животные №№3-6).

Примечание: * - для определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов телочек использовали способ, взятый в качестве прототипа

Пример 4. Способ для определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных использовали для выявления продуктов перекисного окисления липидов в образцах мембран эритроцитов телочек, содержащихся с первого дня жизни в разных условиях двигательной нагрузки: принудительного движения на установке с движущим полом - дважды в день по 30 мин со скоростью 20 м в минуту или на свободном содержании. Получили, что скорость образования ТБК-активных продуктов в мембранах эритроцитов телочек 125-дневного возраста, находящихся с первого дня жизни в условиях принудительного движения, в 3,5 раза и более превышает скорость образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов у телочек 107-дневного возраста, содержащихся с первого дня жизни в стандартных клетках на свободном содержании (табл. 4.).

Таким образом, предлагаемый способ определения скорости перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных может быть использован для выявления особенностей функционирования эритроцитарных мембран животных в процессе адаптации их организма к изменению условий содержания (влияние интенсивности двигательной нагрузки, температурного режима, включение новых кормов в рацион и т.д.).

Изобретение относится к области биологической химии, в частности к гематологии, а именно к лабораторным способам определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения состоит в том, что за счет уменьшения объема мембран эритроцитов при их инкубации (в 6,7 раза по сравнению с прототипом) и отбора содержимого проб для проведения цветной реакции с горячей тиобарбитуровой кислотой, а также за счет уточнения формул для расчета скоростей образования продуктов индуцированного и спонтанного перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов сельскохозяйственных животных. Технический результат состоит в возможности доступно в условиях биохимических лабораторий определять скорость перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов. 4 табл.

Способ определения скорости образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран эритроцитов сельскохозяйственных животных (СХЖ), включающий получение осадка эритроцитов из венозной крови, проведение полного водного гемолиза эритроцитов, получение мембран с помощью центрифугирования, приготовления опытных образцов на основе водной взвеси мембран и исследования ПОЛ в присутствии и без присутствия в опытной пробе прооксидантов: раствора соли Мора, аскорбиновой кислоты, а также осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ), с последующим проведением цветной реакции с тиабарбитуровой кислотой (ТБК) для измерения оптической плотности при 532 или 540 нм и расчетом результатов, отличающийся тем, что гемолиз эритроцитов проводят ледяной водой, в качестве опытных образцов берут взвесь эритроцитов в 6,7 раза меньше по объему, чем в стандартном методе, для проведения цветной реакции используют горячую ТБК, а расчет скорости образования продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов СХЖ производят по формуле

и ,

где Х1 - скорость образования малонового диальдегида (МДА) в присутствии прооксидантов (индуцированное ПОЛ);

Х2 - скорость образования МДА в отсутствии прооксидантов (спонтанное ПОЛ), в нмоль/ч;

0,156 - уровень экстинкции 1 нмоль МДА при 532 нм;

Е1 и Е2 - оптическая плотность соответственно с добавлением и без добавления прооксидантов.