Способ определения чувствительности мембран эритроцитов к свободнорадикальному окислению липидов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к мето-, дам лабораторной диагностики, и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения чувствительности эритроцитов к перекисному окис-4 лению липидов.

Цель изобретения - повышение специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении.

Способ осуществляют следующим образом.

Из 2 мл венозной крови выделяют эритроциты центрифугированием при 300 g в течение 10 мин,в качестве антикоагулянта используют гепарин - 200 ЕД/мл крови. Плазму и верхний слой эритроцитов, содержащий лейкоциты, удаляют отсасыванием. Полученный осадок эритроцитов дважды отмывают, добавляя четырехкратный объем охлажденного физиологического раствора хлорида натрия и осаждая клетки центрифугированием при 300 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов

удаляют отсасыванием.

0,25 мл осадка эритроцитов смешивают.

с 2,4 мл забуференного физиологического раствора NaCl (50 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 7,4 смешивают с -450 мл 0,9% раствора NaCl) и 0,35 мл 0,5% спиртового раствора эргокальцифе- рола (витамина D). В контрольные пробирки вместо спиртового раствора витамина Вг . добавляют равное количество эталона. Инкубацию проводят в течение 30 мин при 37°С в водной бане. После инкубации в пробы медленно добавляют, тщательно перемешивая,

ел

а

оэ

Јь

1,0 мл 50% трихлоруксусной кислоты. Пробирки центрифугируют 15 мин при 300 g. В чистые пробирки отбирают 2,0 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 0,2 мл н.раствора соляной кислоты и 0,8 мл 0,2 И раствора тиобарбитуровой кислоты. После кипячения в течение 10 мин жидкость приобретает розовую окраску, по интенсивности которой и судят о количестве образовавшегося малонового диальдегида (МДА) - в кювете 1 см определяют оптическую плотность раствора при 532 нм против контроля на pe

ЈКТИВЫ.

Расчет продукции МДА в эритроцитах осуществляют с использованием закона Вугера-Ламберта-Бера по форму

ле:

r - agjlilblMlJ - „F -307 69 L -Јуяь эг и/,,

де С - продукция МДА в I мл

осадка эритроцитов за 1 ч 25 инкубации;

Разность экстинкций опытной и контрольной проб на 532 нм;

V - объем пробы для спектро- ,Q фотометрирования;

V - объем пробы после остановки инкубации;

V- - объем пробы, отобранный

для постановки цветной ре-,с акции;

К, - коэффициент пересчета времени инкубации;

К - коэффициент пересчета на

1 мл осадка эритроцитов; о

Ј - коэффициент молярной экстинкций, выраженный в . нм/мл (Оу156).

К 28-33 мин продукция МДА почти 5 достигает максимума и мало изменяется при удлинении инкубации до 1 ч. В пределах интервала времени 28-33 мин прирост продукции МДА является незначительным, поэтому оптимальным вре-Q менем инкубации следует считать 28- 33 мин.

Пример. Из 2 мл венозной крови центрифугированием выделяют эритроциты, в качестве антикоагулянта используют гепарин - 200 ЕД/мл крови. Плазму и верхний слой эритроцитов удаляют. Осадок эритроцитов дважды отмывают четырехкратным объемом охлажден

0

0

5

,Q

,с

о

5 Q

ного физиологического раствора хлорида натрия, осаждая клетки центрифугированием при 300 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов удаляют. 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл забуференного 0,9% раствора NaCl и 0,35 мл 0,5% спиртового раствора витамина D2. Конечная концентрация 0,06%„ В контрольные пробирки вместо спиртового раствора эрго- кальциферола добавляют равное количество этанола . Инкубацию проводят в течение 30 мин при 37°С в водяной бане. После инкубации во все пробирки медленно добавляют, тщательно ne-i ремешивая, 1,0 мл 50% раствора три- хлоруксусной кислоты. Пробирки центрифугируют 15 мин при 300 g. В чистые пробирки отбирают 2,0 мл надоеа- дочной жидкости, к которой добавляют 0,2 мл 1 н.раствора соляной кислоты и 0,8 мл 0,12 М раствора тиобарбитуровой кислоты. После кипячения в течение 10 мин наблюдают появление розовой окраски раствора, интенсивность которой измеряют спектрофотометричес- ки при 532 нм против контроля на реактивы. По формуле рассчитывают содержание МДА, которое в данном случае равно 34,07 нМ/мл-ч. Содержание .МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу, составило 37,84 нМ/мл-ч.

Процесс инкубации эритроцитов составил 30 мин против 1 ч (прототип ) а вместо высокотоксичного и взрывоопасного азида натрия использован нетоксичный и невзрывоопасный эргокаль- циферол, что обеспечивает сокращение времени и упрощение выполнения предлагаемого способа,

П р и м е р 2. Получают осадок эритроцитов, как указано в примере 1. 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл забуференного раствора NaCl и.0,35 мл 0,5% спиртового раствора эргокальциферола. В контрольные пробирю; вместо спиртового раствора витамина D добавляют равное количество этанола. Инкубацию проводят в течение 28 мин при 37е С в водяной бане. Дальнейшая последовательность операций аналогична примеру 1, Спектрофо- тометрическая регистрация интенсивности розовой окраски раствора при длительности инкубации 28 мин и последующий пересчет показывают, что

количество МДА в данном случае рав- но 33,89 нМ/мЛ Ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу, состави- ло 37,59 нМ/мл«ч.

ПримерЗ. Осадок эритроцитов получают аналогично примеру 1. 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл забуференного физиологического раствора NaCl и 0,35 мл 0,5% спиртового раствора эргокальциферо- ла.хВ контрольные пробирки вместо эр гокальциферола добавляют равное количество этанола Инкубацию проводят в течение 33 мин при 37 С в водяной бане. Последующее выявление образовавшегося ВДА проводят аналогично примеру . В данном случае при длительности инкубации 33 мин количество ВДА равно 34,22 нМ/мл-ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу, составило 37,84 нМ/мл-ч.

Анализ полученных данных свидетельствует, что при использовании предлагаемого способа у больных с холестазом определяется повышенная продукция МДА (что подтверждается повышенным накоплением гидроперекисей)

0

5

а при использовании прототипа подобные изменения не были выявлены. Указанное подтверждает большую специфичность и физиологичность предлагаемого способа по отношению к известному техническому решению.

В таблице приведены данные о продукции эритроцитарного ВДА и содержании гидроперекисей (определяют хе- милюминесцентным методом) в мембранах эритроцитов больных вирусным гепатитом В средней степени тяжести (с более тяжелым холестатическим вариантом, заболевания и без него).

Формула изобретения

Способ определения чувствитель- ности мембран эритроцитов к свободно- радикальному окислению липидов путем их инкубации с прооксидантом, добавления тиобарбитуровой кислоты и спектро- фотометрирования, отличающий- с я тем, что, с целью повышения специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении ин- кубацию проводят с раствором эрго-

кальциферола в конечной концентрации 0,06% в течение 28-33 мин.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения чувствительности эритроцитов к перекисному окислению липидов. Цель - повышение специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении. Центрифугируют 2 мл венозной крови, 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл физиологического раствора, добавляют спиртовой раствор витамина Д₂, инкубируют 30 мин, затем добавляет 1,0 мл 50%-ной трихлоруксусной кислоты, центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют раствор соляной кислоты и тиобарбитуровой кислоты, кипятят и спектрофотометрируют. Способ позволяет определять наличие малонового диальдегида.