НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИХ АЛЛЕРГЕНОВ МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно - к разделу иммунологии - аллергологии.

Широкая распространенность аллергических заболеваний вызывает необходимость поисков надежных и эффективных диагностикумов. При диагностике аллергических заболеваний важно определить, на какой именно аллерген (или несколько аллергенов) возникает аллергическая реакция. Для этого врачи-аллергологи используют кожные пробы, что зачастую приводит к дополнительной аллергизации больного и далее к обострению заболевания. Поэтому в последнее время врачи-аллергологи во многих случаях предпочитают диагностику in vitro - определение аллергенспецифического иммуноглобулина E (ИгE) в сыворотке крови.

Имеется ряд подобных диагностикумов, в основе которых лежит принцип иммуноанализа. Фирма "Фармация" (Швеция), имеющая большой опыт в производстве диагностических и лечебных средств для аллергологии, производила набор "RAST", в котором аллергены наносят на целлюлозные диски, а выявляющие антитела несут радиоактивную метку. В последнее время Фармация перешла к иммуноферментному анализу и разработала высокочувствительную "CAP"-систему [1], в которой аллерген нанесен на обладающий большой суммарной поверхностью полимер, заключенный в капсулу; выявляющие антитела конъюгированы с ферментом щелочной фосфатазой. Несмотря на очевидные достоинства - высокую чувствительность, широкий спектр аллергенов, описанный диагностикум требует использования специального оборудования для постановки анализа и регистрации результата. Сам анализ довольно трудоемок, т.к. каждая капсула содержит только один аллерген.

Известен набор [2] для диагностики аллергии in vitro, включающий в себя полистироловые стрипы с сорбированными аллергенами, конъюгат поликлональных анти-ИгE антител с пероксидазой хрена и остальные реагенты, необходимые для проведения анализа. Регистрация результата идет по оптической плотности с помощью многоканального спектрофотометра. Для проведения анализа также необходимо специальное оборудование (многоканальные дозаторы, промывающее устройство и др.).

Наиболее близким по достигаемому техническому результату к предлагаемому набору является набор "IgE Specific SCREEN", выпускаемый фирмой Allergopharma, Швейцария (прототип). Создание его компонентов описывается в статье [3]. В состав набора входят
- индикаторная полоска (10 шт.) с нанесенными аллергенами - 5 разных аллергенов и положительный контроль (рекомбинантный фрагмент ИгE), нанесение в виде точек на отдельные ленты нитроцеллюлозы;
- раствор конъюгата моноклональных антител Le 27 с пероксидазой хрена, см. статью [3];
хромоген - раствор 4-хлор-1-нафтола в метаноле;
- субстратный буфер с H₂O₂;
- концентрированный буфер для промывания индикаторных полосок;
- пластиковая ванночка для инкубации индикаторных полосок.

Однако данный диагностикум обладает рядом недостатков: сыворотка инкубируется в специальных пластиковых ванночках со встряхиванием, соответственно нужен прибор; необходимый для анализа объем сыворотки - минимум 1 мл, а протестировать сыворотку можно одновременно лишь на 5 аллергенов. Промывать индикаторные полоски нужно специальным раствором, который надо готовить из 10-кратного концентрата. Хромоген 4-хлор-1-нафтол дает довольно бледную голубовато-лиловую окраску, что затрудняет визуальную оценку результатов и занижает чувствительность анализа.

Задачей настоящего изобретения является создание набора для выявления сенсибилизирующих аллергенов по наличию сенсибилизирующих иммуноглобулинов E в сыворотке крови человека, лишенного вышеуказанных недостатков. В предлагаемый диагностикум входят
- индикаторная полоска (10 шт.), на рабочей части которой нанесены аллергены (7 равных аллергенов и положительный контроль - кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши); нанесение в виде полос на сплошной лист нитроцеллюлозы;
- раствор конъюгата моноклональных антител IgE/11-1 с пероксидазой хрена (8,0 мл); получение антител описано в статье [4], конъюгирование с пероксидазой осуществлено по модифицированному методу Nakane [5], см. статью [6]; возможность применения рассмотрена в статье [7];
- хромоген A - диаминобензидин (8,0 мг);
- хромоген Б - имидазол (8,0 мг), является усилителем окраски;
- субстратный буфер с H₂O₂.

Проведение анализа.

В одноразовые пробирки вносят 600 - 700 мкл сыворотки пациентов и ставят в них индикаторные полоски; в одну пробирку можно поставить 2 полоски с разными панелями аллергенов "спина к спине"; инкубируют 15 - 20 час (ночь) с постоянным встряхиванием (не обязательно) при комнатной температуре. Затем полоски промывают под проточной водой и ставят в чистые одноразовые пробирки, добавив в них по 700 мкл раствора конюъгата. Инкубируют еще 2 часа при комнатной температуре. Опять промывают под проточной водой и переносят в чистые одноразовые пробирки с проявляющим раствором (который готовят за 5 мин до использования, растворяя хромогены А и Б в субстратном буфере). Через несколько минут развивается темно-коричневая окраска полосы положительного контроля и полос тех аллергенов, на которые реагирует больной.

Основные характеристики набора.

Принцип анализа - двустадийный твердофазный иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител.

Твердая фаза - нитроцеллюлоза.

Время анализа - около 20 часов.

Объем пробы - минимум 500 мкл.

Одновременный анализ на 14 аллергенов.

Оценка результатов - визуальная.

Пример 1. Образцы сывороток 10 пациентов с тяжелой атопической астмой были исследованы на присутствие специфических ИгE к 28 аллергенам. У всех были выявлены ИгE к ингаляторным аллергенам, но отсутствовали ИгE к пищевым аллергенам. Часть больных страдала поллинозом - были выявлены ИгE к пыльце березы, тимофеевки, ольхи, ежи сборной, полыни. У других наблюдалась аллергия на домашнюю пыль - выявлены аллергены клещей D. farinae и D. pteronyssinus, грибковые аллергены Candida, Aspergillus, Alternaria, у одного больного присутствовали ИгE к аллергенам таракана B. germanica.

Пример 2. Образцы сывороток 8 здоровых доноров, не имевших в анамнезе проявлений аллергии, были исследованы на присутствие аллергенспецифических ИгE. Во всех случаях результаты были отрицательными.

Пример 3. Сыворотки 15 детей с атопией были исследованы. В 3-х случаях были обнаружены ИгE к пищевым аллергенам - в одном случае к белку и желтку куриного яйца, у другого пациента - к треске и хеку, у третьего - к коровьему молоку, белку и желтку, цитрусовым и пшеничной муке. У 8 пациентов присутствовали ИгE к аллергенам пыльцы в разных пропорциях; у 6 - к аллергенам домашней пыли.

Результаты анализа совпадают с результатами кожных проб в 60 - 80% случаев, а также соответствуют данным анамнеза.

Таким образом, предлагаемый набор позволяет выявлять сенсибилизирующий аллерген в сыворотке (плазме) крови человека по качественной оценке уровня ИгE-антител к данному аллергену. Регистрация результатов не требует наличия специального клинического оборудования; анализ может проводиться как в обычной поликлинике, в кабинете врача-аллерголога, так и в выездных (полевых) условиях, что удобно для массового скрининга. Кроме удобства и простоты анализа достоинством набора является также и то, что можно менять перечень аллергенов на индикаторных полосках - наносить те или иные аллергены в зависимости от конкретных условий.

ЛИТЕРАТУРА
1. Ewan P. W. , Coote D. Evalution of capsulated hydrophilic carrier polymer (the ImmunoCap) for measurement of specific IgE antibodies & Allergy. 1990, V. 45, N 1, pp. 22 - 30.

2. Гервазиева В.Б., Овсяникова И.Г., Воронкин Н.И. и др. Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения аллергенспецифических IgE-антител. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1987, N 9, С. 33 - 35.

3. Hong C.S., Stadler B.M., Walti M., deWeck A.L. Dot-immunobinding assay with monoclonal anti-IgE antibodies for the detection and quantitation of human IgE, J. Immunol. Methods. 1986, V. 95, pp. 195 - 202.

4. Цыциков Э.Н., Втюрина И.Ю., Галанина О.Е. и др. Моноклональные антитела к иммуноглобулину E человека. Биотехнология. 1988, Т.5, N 3, С. 327 - 359.

5. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody - a new method of conjugation & J. Histochem. Cytochem. 1974, V. 22, pp. 1084 - 1091.

6. Сердюк О.А., Цыциков Э.Н., Василов Р.Г. Иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для определения общего уровня иммуноглобулина E у детей и подростков. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1989, N 6, С. 722 - 724.

7. Смирнова Е.Я., Лебедин Ю.С., Сердюк О.А., Василов Р.Г. Использование моноклональных антител к IgE человека для определения уровня аллергенспецифического IgE. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1990, N 9, С. 93 - 97.

Изобретение относится к биологии и медицине, а точнее - к аллергологии, и касается набора для выявления сенсибилизирующих аллергенов методом твердофазного иммуноферментного анализа. Набор может быть использован для выявления сенсибилизирующих аллергенов при постановке диагноза у аллергических больных с целью дальнейшего ограничения контакта больного с этими аллергенами, для скрининга населения в зонах с высоким риском развития аллергии. Иммуноферментный диагностикум для выявления сенсибилизирующих аллергенов содержит нанесенные на нитроцеллюлозу аллергены и положительный контроль - антитела к IgG мыши, конъюгат моноклональных антител IgE /11-1 с пероксидазой хрена в рабочем разведении 1:500; цитратный буфер с 0,035% H₂O₂, содержащий консервант; имидазол и диаминобензидин, дающие конечную концентрацию в цитратном буфере 0,1% каждый. Преимущество изобретения заключается в расширении количества анализируемых аллергенов и повышении чувствительности.

Набор для выявления сенсибилизирующих аллергенов методом твердофазного иммуноферментного анализа, включающий раствор конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена, хромоген, субстратный буфер с пероксидом водорода, индикаторные полоски с нанесенными аллергенами, положительный контроль, концентрированный буфер для промывания индикаторных полосок, отличающийся тем, что в качестве моноклональных антител используют моноклональные антитела JgЕ /II-I, в качестве хромогена - диаминобензидин и имидазол, в качестве положительного контроля - кроличьи антитела против иммуноглобулина мыши.