СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2004 года по МПК C12P19/34 C07H21/04 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к методам выделения ДНК.

Одним из методов выделения нуклеиновых кислот бактерий и вирусов является обработка микроорганизмов гомогенной смесью фенола с водой. При использовании этого метода после добавления к суспензии микроорганизмов лизирующего раствора происходит образование двух фаз.

Для эффективной депротеинизации нуклеопротеидного комплекса, образующегося после лизиса микробных клеток, смесь реагентов необходимо интенсивно встряхивать, что приводит к механическому повреждению молекул нуклеиновых кислот. Для того чтобы уменьшить гидродинамическое воздействие на молекулы ДНК и увеличить депротеинезирующую и денатурирующую активность фенола, необходимо избавляться от эффекта появления двух фаз. Чтобы предупредить их образование, некоторые исследователи предлагают добавлять в смесь реагентов органические растворители, что позволяет увеличить концентрацию фенола в лизирующем растворе и избежать образования двух фаз при выделении ДНК. Например, метод выделения нуклеиновых кислот вирусов в однофазных системах, где к фенольной фазе добавляют этанол (Тихоненко Т.И., 1962).

Недостатком данного метода является то, что при выделении нуклеиновых кислот бактерий увеличивается риск потери ДНК вследствие ее осаждения этанолом из-за более высокого молекулярного веса.

Цель изобретения - разработка нового способа выделения нуклеиновых кислот для получения препаратов ДНК сальмонелл и хламидий высокой степени чистоты и нативности.

Предлагаемый способ выделения ДНК микроорганизмов с последующей очисткой нуклеиновой кислоты хлороформом отличается от метода выделения нуклеиновых кислот в однофазной системе, где к фенольной фазе добавляют этанол, тем, что разделения реакционной смеси на две фазы во время лизиса клеток удается избежать за счет изменения рН предлагаемого лизирующего раствора до 9,3-9,5, обусловленного образованием при его приготовлении фенолята натрия. Высокая депротеинизирующая активность используемой смеси позволяет заменить резкое встряхивание препарата осторожным медленным перемешиванием и тем самым свести к минимуму гидродинамические воздействия на освобождающиеся нуклеиновые кислоты.

Состав лизирующего раствора: 80% фенол; 18,8% Н₂O; 1,2% NaOH.

Методика приготовления (на 1 г лизирующего раствора): 800 мг кристаллического фенола насыщают 188 мкл деионизированной воды, затем добавляют 12 мг NaOH, pH раствора доводят до 9,3-9,5.

К полученному лизирующему раствору добавляют ДСН до конечной концентрации 1%.

Предлагаемый способ опробован при выделении ДНК сальмонелл и хламидий.

Нами предложена следующая схема выделения ДНК указанных микроорганизмов.

1. 1 мг культуры сальмонелл (или хламидий) суспендируют в 200 мкл дистиллированной воды. К полученной суспензии бактерий добавляют равный объем лизирующего раствора с ДСН, тщательно пипетируют и выдерживают при температуре 37°С в термостате в течение 1 часа, время от времени перемешивая содержимое пробирки аккуратным покачиванием.

2. После экспозиции к лизату добавляют 200 мкл хлороформа, перемешивают содержимое пробирки, пока не образуется эмульсия. Затем смесь центрифугируют при 7000 g в течение 5 мин. Отбирают образовавшуюся водную фазу и повторно проводят экстракцию хлороформом в соотношении 1:1. Вновь проводят центрифугирование экстракта.

3. К извлеченной после последнего центрифугирования водной фазе добавляют 2 объема 96% этанола. Полученную смесь тщательно перемешивают и 1 час экспонируют при -20°С.

4. ДНК осаждают путем центрифугирования при 7000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 70% этанолом и подсушивают при комнатной температуре.

5. Осадок ДНК растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0).

Внимание! Степень чистоты всех используемых реактивов должна быть: "Чистый для анализа".

Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А₂₆₀ /А₂₈₀) колеблются в пределах 1,8-2,0, что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков и органических растворителей.

Практический выход ДНК сальмонелл составлет 10,2-20,4 мкг/мг, хламидий - 10,0-20,2 мкг/мг биомассы микроорганизма.

Для оценки нативности нуклеиновой кислоты растворы ДНК, полученные по указанной схеме, в количестве 1 мкг вносили в лунки 1%-ного агарозного геля, содержащий этидиум бромидом 0,5 мкг/мл, и подвергают горизонтальному электрофорезу в буфере ТВЕ при напряжении 10 в/см в течение 1-2 часов (чертеж). ДНК сальмонелл (поз. 1) и хламидий (поз. 2) определяют по наличию светящейся в ультрафиолетовом свете полосы, на расстоянии 0,2-0,5 см от лунки, в которую была внесена проба.

Источники информации

Тихоненко Т.И. Получение и характеристика высокополимерных дезоксирибонуклеиновых кислот из бактериофагов // Ж. Биохимия. - Т.27. - Вып.6. - 1962. - С. 1015-1021.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения ДНК микроорганизмов. ДНК микроорганизмов выделяют путем разрушения микробных клеток лизирующим раствором, содержащим 80% фенола, 18,8% Н₂О и 1,2% NaOH (рН 9,3-9,5). Способ позволяет получить препараты микробиальной ДНК высокой степени чистоты и нативности. 1 ил.

Способ выделения ДНК микроорганизмов, включающий лизис микробных клеток, депротеинизацию и осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что разрушение микробных клеток проводят лизирующим раствором, содержащим 80% фенола; 18,8% Н₂О и 1,2% NaOH (рН 9,3-9,5).