СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ХРОМОСОМНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ YERSINIA PESTIS Российский патент 2004 года по МПК C12P19/34 C07H21/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных работах для создания новых профилактических и диагностических препаратов, получения биологически активных веществ.

Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании лизоцима, додецил сульфат натрия, в качестве индукторов лизиса клеточной стенки с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом (Marmur J.A. Procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms// J. Mol. Biol. - 1961. - Vol. 3. - P.208-218).

Данный метод трудоемок в исполнении и не позволяет разделять плазмидную и хромосомную ДНК, применяются токсичные материалы.

Известен способ выделения плазмидной ДНК (Birnboim С.С., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA// Nucleic. Acid. Res. – 1979 - V. 7 - P.1513), заключающийся в лизисе клеток с применением лизоцима, додецил сульфат натрия, NaOH, концентрирование ДНК производят с использованием ПЭГ - 6000, с последующим помещением супернатанта в ледяную баню на 1,5 ч и его центрифугированием. Выделение плазмидной ДНК осуществляют центрифугированием при 40000 об/мин в течение 48 ч.

Однако данный метод авторы рекомендуют лишь для выделения плазмидной ДНК.

Известен метод выделения ДНК, основанный на использовании для лизиса многокомпонентных буферных растворов (Авторское свидетельство СССР №1439124, МКИ С 12 N 15/00). При осуществлении данного способа выращенную на двух флаконах культуру помещают между двумя слоями лизирующей смеси, имеющей состав: бридж-58 1%, дезоксихолат натрия 0,5%, додецил сульфат натрия 0,1%, ЭДТА 10 мМ, лизоцим 5 мг/мл, бромистый этидий 0,5 мг/мл, трис 50 мМ. Содержимое выдерживают при комнатной температуре в течение 3 ч. Этим достигается лизис, при котором ДНК освобождается из клетки и отделяется от прочих продуктов деструкции последующим ультрацентрифугированием при 40000 об/мин и температуре 10°С в течение 40 ч в градиенте плотности хлористого цезия. После чего отобранную ДНК освобождают по общепринятой методике от бромистого этидия (Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. - М.: Мир, 1984. - 480 С.).

Однако процесс лизиса происходит с использованием многокомпонентной лизирующей смеси и одномоментная загрузка всех компонентов не способствуют глубокому лизису, так как контакт бактерий с лизирующим раствором происходит на границе их раздела, что увеличивает время подготовки к выделению ДНК.

Известен метод выделения плазмидной ДНК с помощью саркозила (Федотов Э.Ф., Куличенко А.Н., Попов Ю.А. Быстрый метод получения очищенной плазмидной ДНК чумного микроба. // Лабораторная диагностика и генетика вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Труды противочумных учреждений СССР. Саратов, 1990, С.95-98). Метод основан на использовании лизоцима и саркозила как основного лизирующего агента в течение 30 мин при +50°С и центрифугировании лизата при 80 000 об/мин в течение 5 ч. ДНК собирают, экстрагируют бромистый этидий изоамиловым спиртом и переосаждают этанолом.

Однако саркозил не обладает литическим действием в отношении клеток ряда штаммов возбудителя чумы и других энтеробактерий, выделяется небольшое количество ДНК. Способ пригоден для работы только с авирулентными штаммами бактерий, так как отсутствует этап инактивации культуры и необходимо применение лизоцима, что делает процесс лизиса клеток более трудоемким.

Наиболее близким техническим решением является способ выделения плазмидной ДНК (Фурсов В.В., Попов Ю.А. Простой и эффективный метод обнаружения и выделения плазмид из клеток чумного микроба. //Микробиология, генетика и иммунология чумы и холеры. Труды противочумных учреждений СССР, Саратов, 1983, С.31-34).

Выращенную на жидкой питательной среде культуру осаждают центрифугированием, отмывают трис-сахарозой, затем полученный осадок суспендируют в указанном растворе с последовательным добавлением компонентов лизирующего раствора, включающего лизоцим, ЭДТА, тритон Х-100 и инкубируют при +4°С в течение 16 ч, детрит осаждают центрифугированием в течение 1 ч при 20000 об/мин. Затем осуществляют очистку ДНК от компонентов клетки и выделяют плазмидную ДНК в градиенте плотности хлористого цезия с добавлением этидиума бромида, с последующим отбором ДНК и освобождением от этидиума бромида.

В описанном способе выделения ДНК используют многокомпонентный лизирующий раствор, что делает этот процесс трудоемким, длительным, дорогостоящим, а также отсутствует этап инактивации культуры, что не позволяет работать с вирулентными штаммами патогенных микроорганизмов.

Изобретение решает задачу выделения хромосомной ДНК высокой степени очистки из бактериальных клеток вирулентных штаммов.

Сущность изобретения заключается в том, что культуру, выращенную на твердой питательной среде, инактивируют хлороформом, смывают с поверхности среды и в суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1%, затем инкубируют при температуре +37°С в течение 1 ч, детрит осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 28000 g.

Предлагаемый способ выделения хромосомной ДНК осуществляют следующим образом: культуру бактериальных клеток, выращенную во флаконе с 75 мл скошенного агара Хоттингера (рН 7,2), инактивируют хлороформом. Затем культуру смывают 5% раствором сахарозы в TES буфере, добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубируют в течение 1 ч при +37°С. Осаждение детрита осуществляют центрифугированием при 28000 g в течение 30 мин. В супернатант добавляют NaCl и этанол, после инкубации ДНК осаждают центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин, суспендируют в TES-буфере и добавляют хлористый цезий и бромистый этидий. Белки из раствора удаляют центрифугированием при 28000 g в течение 40 мин. Жидкую фазу, содержащую ДНК, центрифугируют при 250000 g в течение 20 часов с последующим отбором хромосомной ДНК. Отобранную ДНК по общепринятой методике освобождают от бромистого этидия.

Заявляемый способ подробно описан в примерах.

Пример 1. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма Yersinia pestis 358/12.

Клетки исследуемого штамма Y. pestis высевают бактериальной петлей №2 на чашку с плотной агаровой cредой LB (рН 7,2) или агара Хоттингера (рН 7,2) и выращивают при температуре 28°С. После 24-48 ч инкубации культуральную массу бактерий петлей №2 высевают во флакон с 75 мл скошенного агара LB (рН 7,2) или агара Хоттингера (рН 7,2). Спустя 24-48 ч инкубации при температуре 28°С во флакон добавляют 0,5 мл хлороформа и дополнительно инкубируют 45-60 мин при комнатной температуре для инактивации культуры. Культуру смывают 5-ю мл 5%-ного раствора сахарозы в TES (состав TES-буфера: трис(гидроксиметиламинометан) 5 мМ, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,5 мМ, NaCl 5 мМ, рН 8,0) с использованием стеклянного шпателя, переносят пастеровской пипеткой в герметично закрывающиеся центрифужные стаканы ротора Beckman JA-20 (V=40 мл) центрифуги Beckman J2-21, добавляют тритон Х-100 до концентрации 1% и лизируют в течение 1 ч при температуре +37°С.

Осаждение детрита осуществляют при 28000 g (12000 об/мин) в течение 30 мин. Супернатант отбирают, переносят в центрифужные стаканы ротора Beckman JA-14 (V=250 мл) центрифуги Beckman J2 - 21, добавляют навеску NaCl до конечной концентрации 1 М и два с половиной объема 96° этилового спирта (или один объем 2-изопропанола). Инкубируют в течение ночи при температуре +4°С. После инкубации содержимое центрифугируют при 15000g (10000 об/мин) в течение 30 мин. Осадок суспендируют в TES и переносят в центрифужные стаканы ротора Beckman JA-20 с добавлением навески хлористого цезия (1,1 мг/мл) и 1/10 объема бромистого этидия (5 мг/мл). Флотацию белков производят при 28000 g (10000 об/мин) в течение 40 мин.

Жидкую фазу переносят в пробирки для ультрацентрифугирования ротора Beckman 70,1 Ti (3,5 мл) центрифуги Beckman TL 100 и центрифугируют при 250000 g (60000 об/мин) в течение 20 ч при температуре +4°С. Отбор верхней полосы осуществляют при длинноволновом ультрафиолетовом свете (300-350 нм) в центрифужные пробирки ротора Beckman JA-21 (10 мл) центрифуги Beckman J2-21 стандартным способом через иглу (Маниатис Т. с соавт., 1984). После отбора содержимое разводят 1:1 TES и смешивают с одним объемом 2-изопропанола, оставляют в ночь при температуре -20°С. Последующее центрифугирование проводят при 25000 g (10000 об/мин) в течение 15 мин. Растворение осадка ДНК и переосаждение с этанолом осуществляют по стандартной методике (Маниатис Т. с соавт., 1984).

Количество хромосомной ДНК, выделенной из культуры штамма Y. pestis 358/12, выращенного на 75 мл скошенного агара, составляет до 130 мкг.

Пример 2. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма Yersinia pseudotuberculosis 414.

Выращивание культуры и выделение ДНК проводят в тех же условиях, что и в примере 1. Выход ДНК из одинакового количества биомассы соответствует примеру 1 и составляет 130 мкг.

Пример 3. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма Escherichia coli НВ 101 (pBR322).

Культуру выращивают при температуре +37°С. Выделение ДНК проводят аналогично примеру 1. Выход ДНК составляет 195 мкг, что в 1,5 раза больше, чем в примере 1, так как количество получаемой биомассы клеток Escherichia coli больше.

Использование в качестве лизирующего вещества тритона Х-100 позволяет обойтись без литических ферментов, тем самым сокращается число операций с клеточным лизатом. Это способствует уменьшению возможности гидродинамического повреждения нуклеиновых кислот, а оптимально подобранные температурные условия и концентрация лизирующего вещества обеспечивают мягкий и полный лизис клеток бактерий. Предлагаемый для осаждения клеточного дебриса режим центрифугирования 28000 g в течение 30 мин обеспечивает осветление лизата при сокращении времени данной операции.

Следует отметить эффективность заявляемого способа, заключающегося в сокращении времени выделения хромосомной ДНК, увеличении выхода конечного продукта, а также его экономичность, достигаемая за счет использования однокомпонентного лизирующего раствора, позволяющего эффективно осуществлять лизис клеток. Из культуры, выращенной на 75 мл скошенного агара, выход целевого продукта составляет от 130 мкг до 195 мкг для различных микроорганизмов.

Предлагаемый способ выделения позволяет при соблюдении санитарных правил СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности" получать хромосомную ДНК высокого уровня очистки, пригодную для создания новых профилактических и диагностических препаратов, получения биологически активных веществ из клеток как авирулентных, так и вирулентных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной природы.

Таким образом, разработан эффективный, более экономичный способ выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток, позволяющий работать с патогенными микроорганизмами, получать высокоочищенную хромосомную ДНК, пригодную для создания новых профилактических и диагностических препаратов, получения биологически активных веществ.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток. Культуру клеток yersinia pestis выращивают на твердой питательной среде, инактивируют хлороформом и смывают с поверхности среды. В полученную суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубируют при температуре +37°С в течение 1 часа. Затем ДНК очищают от клеточного детрита и проводят ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием. Способ позволяет получить высокоочищенную хромосомную ДНК возбудителя чумы в препаративном количестве и с длительным сроком хранения.

Способ выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток возбудителя чумы Yersinia pestis, включающий выращивание культуры, лизис клеток, очистку ДНК от компонентов клетки и ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием с последующим удалением бромистого этидия, отличающийся тем, что культуру, выращенную на твердой питательной среде, инактивируют, смывают и в суспензию клеток добавляют лизирующее вещество Тритон Х-100 до концентрации 1%, затем инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С.