СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-ЕРА (ЭКЗОНУКЛЕАЗНО-ПОЛИМЕРАЗНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ (EXONUCLEASE-POLIMERASE AMPLIFICATION) Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярно-генетическим методам детекции микроорганизмов.

Одним из молекулярно-генетических методов детекции микроорганизмов является SDA (Strand Displacement Amplification) [1].

Амплификация с вытеснением цепи (SDA) использует свойство ДНК-полимеразы, лишенной экзонуклеазной активности синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя рестрицированную цепь. Предварительно в ходе инициирования реакции с использованием специальных затравок создается сайт рестрикции для эндонуклеаз, например HincII. Поскольку в качестве предшественников в синтезе используются модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты, такие как тиопроизводные аденозина (в случае использования эндонуклеазы рестрикции HincII), гидролиз рестриктазой HincII приводит к образованию насечки (гидролизуется одна цепь), в то время как вторая цепь остается нативной. SDA относится к классу изотермических реакций. Изотермические методы в отличие от ПЦР и ЛЦР позволяют отказаться от сложной и дорогостоящей аппаратуры и использовать в качестве инкубаторов лабораторные термостаты. Этот метод амплификации позволяет получить до 10⁶-10⁷ копий на одну используемую матрицу [1].

Цель изобретения - разработка нового молекулярно-генетического метода детекции микроорганизмов.

Предлагаемый метод детекции микроорганизмов отличается от метода SDA тем, что амплификация исследуемого участка генома происходит в результате использования 4 дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров, комплементарных к соответствующим последовательностям на противоположных цепях нуклеиновой кислоты: первые два ("А", "В") - комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты, остальные два ("a", "b") - идентичные "А" или "В", но имеющие дополнительные нуклеотиды в направлении 3' (так называемые "3' концевые участки") также комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты.

Дезоксирибоолигонуклеотиды "А" и "В" после отжига на ДНК матрицах (схема №1) и инициации синтеза новых цепей ДНК полимеразой фрагмент Кленова (3'-5' ехо^-) [2] удаляются от матриц в результате их расщепления ферментом экзонуклеаза Т7, присутствующей в реакционной смеси.

Экзонуклеаза Т7 катализирует ступенчатое удаление мононуклеотидов с 5' конца двухцепочечной ДНК [3], освобождая место отжига для копий или других дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров.

Активность экзонуклеазы Т7 на синтезированные цепи ДНК блокируется в результате использования тиопроизводных дезоксинуклеозидтрифосфатов -[alpha]-S-dNTPs: [alpha]-S-dATP, [alpha]-S-dCTP, [alpha]-S-dGTP и [alpha]-S-dTTP [1].

Образующиеся в результате разрушения праймеров однонитевые участки ДНК служат местом отжига для копий ранее расщепленных праймеров, которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных цепей.

После синтеза новых цепей ДНК полимеразой фрагмент Кленова (3'-5' ехо^-) освобождаются ранее синтезированные цепи ДНК, которые служат матрицами для праймеров "В" и "А".

Синтез новых цепей и последующее их вытеснение позволяет праймерам "а" и "b" гибридизироваться с ними так называемыми "3' концевыми участками" и инициировать синтез ДНК.

Дезоксирибоолигонуклеотиды "а" и "b" после отжига и инициации синтеза новых цепей ДНК и гибридизированных матриц полимеразой фрагмент Кленова (3'-5' ехо^-) также удаляются от матриц в результате их расщепления ферментом экзонуклеаза Т7, присутствующей в реакционной смеси.

Образующиеся в результате разрушения праймеров однонитевые участки ДНК служат местом отжига для праймеров "А" и "В", а также, но в гораздо меньшей степени копий ранее расщепленных праймеров "а" и "b" (реакция проходит в изотермических условиях при температуре 37°С, более благоприятных для отжига праймеров "А" и "В"), которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных цепей.

Такая стратегия позволяет проводить амплификацию ДНК в прогрессии, достаточной для последующей визуализации (из одной исследуемой мишени молекулы ДНК может амплифицироваться до 10¹¹ копий двухцепочечной ДНК с тупыми концами за 4-6 часов), причем образующиеся ампликоны идентифицируются в электрофореграммах как следующие фрагменты:

")(" - амплифицированные двухцепочечные фрагменты ДНК с тупыми концами, ограниченные по 5' концам последовательностями дезоксирибонуклеотидов, идентичных так называемым "3' концевым участкам" праймеров "а" и "b";

"][" - не менее чем в 8 раз слабее сигнал (часто не видимый в электрофореграмме) по сравнению с ")(", что связано с механизмом амплификации и короче ")(" на число ограниченных по 5' концам последовательностей дезоксирибонуклеотидов, идентичных так называемым "3' концевым участкам" праймеров "а" и "b".

В процессе амплификации двухцепочечных фрагментов с тупыми концами ")(" и "][" нарабатываются так называемые "фоновые" фрагменты ДНК, обладающие разным размером ампликонов (недосинтезированные и не вытесненные цепи ДНК, недорушенные затравки на матрицах в момент непосредственного анализа).

Поэтому для детекции в ЕРА следует ориентироваться на самый яркий сигнал с заданной длиной ампликонов.

Условия проведения реакции

Экзонуклеазно-полимеразная амплификация (Exonuclease-Polymerase Amplification) на примере детекции Chlamydia psittaci:

ЕРА выполняется в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл охлажденной в ледяной бане, но предварительно денатурированной кипячением исследуемой пробы ДНК, подготовленной любым методом выделения нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований; 50 mM ацетата калия, 20 mM трис-ацетата (рН 7.9), 10 mM ацетата магния, 1 mM дитиотрейтола, 200 мкМ [alpha]-S-dNTPs, по 1 мкМ каждого из четырех дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров ("А", "В", "а", "b"), 5 единиц фрагмента Кленова (3'-5' ехо^-), 1 единица экзонуклеазы Т7.

Реакцию проводят при температуре 37°С в условиях термостата в течение 4-6 часов с последующей визуализацией амплифицированной ДНК методом гель электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивают с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н₂О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносят в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл, и подвергают горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 0 В/см в течение 1-1,5 часов с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).

Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры выбраны на основе анализа консервативного участка генома Chlamydia psittaci (СР. SEQ):

5'[(gcaagacactc)ctcaaagccat]taattgcctacaggatatcttgtctggctttaacttgg acgtggtgccgccagaagagcaaattagaatagcgagcacaaaaagaaaagatactaagc ataatctttagaggtgagtatgaaaaaactcttgaaatcggcattattgtttgccgctac gggttccgctctctccttacaagccttgcctgtagggaacccagctgaaccaagtttatt aat[cgatggcact(atgtgggaagg)]3'.

СР. SEQ представляет собой последовательность длиной 264 пары нуклеотидов (п.н.), включившую в себя 139 п.н. из 5'-не транслируемого региона и 125 п.н. из транслируемого региона, кодирующего синтез первых 41-42 аминокислот большого белка наружной мембраны возбудителя.

Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "А" 5'(gcaagacactc)3' идентичен основаниям - 139-129 5' не транслируемого региона;

Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "a" 5'[(gcaagacactc)ctcaaagccat]3' идентичен основаниям - 139-118 5' не транслируемого региона;

Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "В" 5'(ccttcccacat)3' комплементарен к основаниям 115-125 транслируемого региона;

Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "b" 5'[(ccttcccacat)agtgccatcg]3' комплементарен к основаниям 105-125 транслируемого региона.

Результатом предлагаемого метода ЕРА со специфичными для Chlamydia psittaci дезоксирибоолигонуклеотидными праймерами "А", "В", "а", "b" проб ДНК штаммов Chl. psittaci "КС-93", "ПП-87", "250" является амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 242 пар нуклеотидов (чертеж).

Источники информации

1. STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION /Inventor - Walker/ United States Patent №5,455,166 / Date of Patent *Oct.3, 1995.

2. Derbyshire, V. et al. (1988) Science 240, 199-201.

3. Kerr, С. and Sadowski, P. D. (1972)./.J.Biol. Chem. 247, 305-318.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике. Предложенный способ изотермической реакции амплификации предусматривает инкубирование в присутствии буферной системы одноцепочечной пробы исследуемой нуклеиновой кислоты с полимеразой, экзонуклеазой Т7, α-S-dNTPs и двумя парами специфических дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров, где последовательность первой пары праймеров идентична 5'-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а последовательность второй пары праймеров комплементарна 3'-концевой последовательности смысловой цепи. Праймеры каждой пары различаются между собой наличием на 3'-конце одного из них дополнительных нуклеотидов. Применение изобретения позволяет удешевить детекцию микроорганизмов. 1 ил.

Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации, включающий подготовку одноцепочечной пробы исследуемой ДНК, внесение указанной пробы в реакционную смесь, состоящую из буферной системы, олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, полимеразы и dNTPs, инкубацию реакционной смеси при температуре 37°С в термостате в течение 4-6 ч и анализ продуктов реакции методом гель-электрофореза на предмет выявления специфичного для определенного микроорганизма амплифицированного фрагмента, отличающийся тем, что осуществляют изотермическую реакцию амплификации, обозначаемую как ЕРА, которая предусматривает, что в качестве dNTPs применяют α-S-dNTPs, в реакционную смесь добавляют экзонуклеазу Т7 и используют четыре олигодезоксирибонуклеотидных праймера "А", "а" и "В", "b", где праймер "а" отличается от "А", а праймер "b" - от "В" наличием дополнительных нуклеотидов на их 3'-конце, причем праймеры "А" и "а" идентичны 5'-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а "В" и "b" комплементарны ее 3'-концевой последовательности.