СПОСОБ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ 1-3 ЛЕТ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 G01N21/76 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике, и может быть использовано для прогнозирования течения патологического процесса.

Острые кишечные инфекции (ОКИ) представляют одну из актуальных проблем здравоохранения не только в нашей стране, но и во всем мире (1, 2). В России заболеваемость ОКИ у детей остается на высоком уровне, устойчиво занимая 2 место в структуре инфекционных заболеваний.

Однако, несмотря на актуальность данной проблемы, многие вопросы в изучении ОКИ требуют дальнейшей разработки. Существующие традиционные методы лабораторной диагностики ОКИ не позволяют на ранних этапах заболевания оценить ответную реакцию организма на патогенное действие инфекционно-токсических факторов, определить роль механизмов резистентности, критерии прогнозирования течения заболевания.

Не вызывает сомнений ключевая роль иммунной системы в развитии любых патологических процессов (3, 4, 5).

Реактивность иммунной системы в значительной степени определяет тяжесть любого инфекционного процесса. Различные звенья иммунной системы тесно взаимосвязаны между собой, в связи с чем, недостаточность одного из них, приводит к срыву всего механизма иммунореактивности (5, 6, 7).

Состояние иммунореактивности в настоящее время в основном оценивается иммунологическими методами, фиксирующими преимущественно морфологические особенности клеток иммунной системы, в меньшей степени, их функциональную активность. Между тем доказано, что уровень иммунореактивности определяется не только морфологическим составом иммунокомпетентных клеток и концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови, но и уровнем метаболических процессов в иммунокомпетентных клетках, которые в значительной степени определяют функциональную активность иммуноцитов (8, 9, 10). Особенно высокой информативностью для исследования метаболизма активированных лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты. Это связано с тем, что, являясь основными переносчиками электронов в клетке, они осуществляют ключевые реакции клеточного метаболизма и координируют сопряженные метаболические пути (11, 12, 13, 14). Инкубация лимфоцитов крови человека в течение 48-72 часов с митогенами приводит к параллельному увеличению активности всех ферментов гликолиза и цикла Кребса (10, 15). Так как вместе с уровнем активности гликолитических ферментов увеличивается синтез белка и РНК, авторы предполагают, что возросший уровень метаболических ферментов целиком определяется синтезом de novo. Уже не вызывает сомнений, что в основе функциональных проявлений лимфоцитов лежат их метаболические реакции. Предлагается в качестве структурной основы иммунной системы совместно с морфологическими данными использовать метаболические показатели иммунокомпетентных клеток (16, 17, 18).

В литературных источниках мы обнаружили исследования по изучению функциональной активности лимфоцитов крови биолюминесцентным методом (19). Между тем исследований, касающихся ОКИ нет, хотя можно предположить, что разнообразие клинических вариантов развития ОКИ у детей обусловлено различными дефектами в функционировании системы метаболизма лимфоцитов.

Целью изобретения является определение метаболической активности лимфоцитов крови на ранних этапах болезни в качестве прогноза течения ОКИ у детей 1-3 лет жизни. Поставленную цель осуществляют за счет того, что при снижении активности Г6ФДГ в лимфоцитах крови до 0,47±0,10 мкЕ и НАДФМДГ до 1,42±0,33 мкЕ прогнозируют негладкое течение заболевания, а при повышении уровня активности НАДФГДГ до 2,97±0,53 мкЕ прогнозируют гладкое течение ОКИ.

Способ осуществляют следующим образом. Забор крови проводят утром натощак по общепринятым правилам. Венозную кровь из локтевой вены забирали в пробирки с гепарином; затем выделение лимфоцитов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколлверографина по методу A.Boyum (20). Для определения активности дегидрогеназ лимфоцитов крови суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, после однократного замораживания-размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем производили непосредственное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в табл.1. После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут (для ферментативных реакций с восстановлением НАД(Ф)⁺) или 5 минут (для реакций с окислением НАД(Ф)Н) к 200 мкл инкубационной смеси добавляли 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разведены в 0,1 М К¹, Na¹ - фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра "БЛМ-8803" (сконструирован в СКТБ "Наука", г. Красноярск) производили измерение свечения.

Ферментативная система НАД(Ф)Н: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска.

Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, нами определялись показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производили в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносили буфер.

Для построения графика зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график) 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносили в кюветы биолюминометра, содержащие биолюминесцентные реактивы в концентрациях, указанных выше, после чего производилось измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы (11), калибровочные графики строились для каждого рН буфера.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле:

где Δ[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента";

V - объем пробы в миллилитрах;

Т - время инкубации.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 10⁴ клеток, где 1 Е=1 мкмоль/мин (21).

При исследовании уровней активности метаболических ферментов в лимфоцитах крови у детей 1-3 лет с ОКИ с помощью биолюминесцентного метода обнаружены специфические особенности, которые характерны для гладкого и негладкого течения инфекционного процесса. Так, у детей с негладким течением ОКИ выявляется выраженное снижение активности Г6ФДГ в лимфоцитах крови статистически достоверное как относительно контрольного диапазона, так и параметров активности при гладком течении ОКИ (2,21±0,40 мкЕ; 2,38±0,43 мкЕ; 0,47±0,10, Р<0,01, соответственно, в контроле и у больных с гладким и негладким характером течения ОКИ). Также, у данной обследуемой группы детей выявляется статистически достоверное снижение внутриклеточной активности НАДФМДГ относительно контрольного диапазона и обнаруженного у больных с гладким течением ОКИ (8,63±1,64 мкЕ; 14,17±3,25 мкЕ; 1,42±0,33 мкЕ, Р<0,01, соответственно, в контроле и у больных с гладким и негладким характером течения ОКИ). Только относительно диапазона, выявленного у детей с гладким течением ОКИ, обнаружено достоверное снижение уровней активности НАДФГДГ у больных с негладким течением инфекционного процесса (0,52±0,17 мкЕ; 2,97±0,51 мкЕ, Р<0,01, соответственно, у больных с негладким и гладким характером течения ОКИ) (табл.2). Г6ФДГ и НАДФМДГ определяют интенсивность реакций, связанных с анаболическими процессами. Продукты Г6ФДГ используются в реакциях макромолекулярного синтеза. НАДФМДГ катализирует ключевую реакцию липидного анаболизма. Снижение уровня активности Г6ФДГ и НАДФМДГ позволяет предположить пониженный уровень достаточно широкого ряда синтетических процессов, а снижение активности НАДФГДГ - ингибирование переноса субстратов для реакций лимонного цикла.

Пример 1.

Больная Диана X., 1 г. 4 м, поступила в стационар с диагнозом: кишечная инфекция, гастроэнтероколит, тяжелый, токсикоз с эксикозом II степени. Из анамнеза заболевания известно, что девочка заболела остро с появления многократной рвоты, частого жидкого стула, повышения температуры до 39,0°. Состояние при поступлении тяжелое. Обследование крови, проведенное в стационаре по предлагаемому способу, показало наличие снижения активности Г6ФДГ до 0,42 мкЕ и НАДФМДГ до 1,39 мкЕ, в связи с чем было заподозрено негладкое течение заболевания. Больной проводилось комплексное лечение, однако, улучшения состояния не наблюдалось. Сохранялась гипертермия, симптомы интоксикации. В развернутом анализе крови были обнаружены воспалительные изменения. При дальнейшем обследовании выявилось наличие у ребенка инфекции мочевыводящих путей. Бак. посев кала дал рост Salmonella enteritidis.

На основании клинических данных и в результате проведенного комплексного обследования был выставлен диагноз: сальмонеллез (Salm. enteritidis), гастроэнтероколит, тяжелый, токсикоз с эксикозом II степени, острое негладкое течение. Инфекция мочевыводящих путей.

Особенностью метаболизма лимфоцитов крови у детей с гладким течением ОКИ является наличие тенденции к увеличению уровня активности НАДФГДГ (1,57±0,63 мкЕ; 2,97+0,53 мкЕ, Р<0,05; 0,52±0,17 мкЕ, Р<0,01, соответственно, в контроле и у больных с гладким и негладким течением ОКИ) (табл.2). Повышение активности вспомогательных дегидрогеназных реакций - НАДФГДГ - стимулирует субстратный поток по лимонному циклу за счет повышения переноса субстратов.

Пример 2.

Больной Дима Д., 2 г. 5 мес, поступил в стационар с диагнозом: кишечная инфекция, энтероколит средней тяжести. Из анамнеза заболевания известно, что ребенок заболел остро с появления болей в животе, жидкого стула до 8 раз в день с патологическими примесями, повышения температуры до 38,5°. Состояние при поступлении средней тяжести. Обследование крови, проведенное в стационаре по предлагаемому способу, показало наличие увеличения активности НАДФГДГ до 2,93 мкЕ, в связи с чем было предположено гладкое течение заболевания. Больному проводилось комплексное обследование и лечение. В развернутом анализе крови были обнаружены воспалительные изменения. Бак. посев кала дал рост Shigella Flexneri. В результате проведенного лечения быстро наступила положительная динамика - симптомы интоксикации купированы к 5 дню, стул нормализовался к концу недели.

На основании клинических данных и в результате проведенного комплексного обследования был выставлен диагноз: Шигеллез (Sh. Flexneri), типичный, средней тяжести, острое гладкое течение.

Таким образом, применение биолюминесцентного анализа для исследования функциональной активности лимфоцитов крови у больных 1-3 лет в зависимости от течения ОКИ показывает, что у детей с негладким течением ОКИ выявляется пониженный уровень широкого ряда синтетических процессов, проявляющийся в снижении активности Г6ФДГ и НАДФМДГ. У больных детей с гладким течением ОКИ выявляется стимуляция субстратного потока по циклу Кребса, проявляющаяся повышением активности НАДФГДГ.

Использование биолюминесцентного анализа для определения показателей активности ферментов лимфоцитов крови в зависимости от течения инфекционного процесса по сравнению с традиционными лабораторными методами позволяет с достаточной точностью на ранних этапах заболевания выявить больных с более глубокими изменениями метаболического статуса лимфоцитов, что может быть использовано для определения прогноза течения кишечной инфекции. В свою очередь своевременная оценка течения ОКИ по состоянию активности метаболических ферментов лимфоцитов крови на ранних этапах заболевания позволит проводить адекватную терапию с включением в комплекс лечебных мероприятий средств иммунокоррекции.

Источники информации

1. Учайкин В.Ф. Руководство по инфекционным болезням. - М., 1999. – 809 с.

2. Краснов В.В. Инфекционные болезни в практике педиатра. - Нижний Новгород, 1997. - c.97.

3. Педиатрия. - 1992. - №1. - с.93-100.

4. Йегер Л. Клиническая иммунология и аллергология. / Пер. с нем. - М.: Медицина. 1990. - T.1. – 528 с.

5. Петров Р.В., Орадовская И.В. Эпидемиология иммунодефицитов. - М.: Медицина. 1988. – 116 с.

6. Педиатрия. - 1988. - №10. - с.43-47.

7. Хахалин Л.Н., Гомес Л.А., Порховатый С.Я. и др. Клиническая диагностика иммунологической недостаточности у детей.//Методические рекомендации/Под ред. Р.В.Петрова. - М., 1986. – 39 с.

8. Куртасова Л.М., Савченко А.А., Манчук В.Т. Метаболические аспекты иммунных нарушений у детей с заболеваниями органов дыхания. - Новосибирск: СО РАМН, 2001. - 107 с.

9. Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1995. - Т.119, №2. - С.181-183.

10. De Azevedo R.B., Rosa L.F., Lacava Z.G., Curi R. Gonadectomy impairs lymphocyte proliferation and macrophage function in male and female rals. Correlation with key enzyme activities of glucose and glutamine metabolism//Cell Biochem.Funct. - 1997. - Vol.15, №4. - P.293-298.

11. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

12. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. - М.: Высш. школа, 1998. - 479 с.

13. Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2000. - Т.129, №1. - С.53-55.

14. Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2001. - Т.131, №4. - С.392-395.

15. Moriwaki Y., Yamamoto 1., Higashino К. Enzymes involved in purine metabolism - a review of histochemical localization and functional implications//Histol. Histopathol. - 1999. - Vol.14, №4. - P.1321-1340.

16. Захарова Л.Б., Манчук В.Т., Нагирная Л.А. Метаболизм иммунокомпетентных клеток жителей Севера в онтогенезе. - Новосибирск, 1999. – 144 с.

17. Савченко А.А. Нарушение метаболического статуса лимфоцитов и иммуноэндокринного взаимодействия в патогенезе вторичных иммунодефицитов и гиперактивного состояния иммунной системы: Автореф. дис...докт. мед. наук. - Томск, 1996. – 34 с.

18. Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1995. - Т.119, №2. - С.181-183.

19. Лаб. дело. - 1991. - №11. - С.22-25.

20. Boyum A. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol.21 (Suppl.97). - P77-80.

21. Светящиеся бактерии//И.И.Гительзон, Э.К.Родичева, С.Е.Медведева и др. - Новосибирск: Наука, 1984. - 278 с.

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике, и предназначено для прогнозирования течения острых кишечных инфекций у детей 1-3 лет. Проводят исследование крови. Определяют метаболическую активность лимфоцитов биолюминесцентным методом. При снижении активности в лимфоцитах НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ: Г6ФДГ до 0,47±0,10 мкЕ и НАДФМДГ до 1,42±0,33 мкЕ прогнозируют негладкое течение заболевания. При повышении уровня активности НАДФГДГ до 2,97±0,53 мкЕ прогнозируют гладкое течение заболевания. Способ позволяет с достаточной точностью на ранних этапах заболевания прогнозировать течение острых кишечных инфекций. 2 табл.

Способ прогноза течения острых кишечных инфекций у детей 1-3 лет, включающий исследование крови, отличающийся тем, что определяют метаболическую активность лимфоцитов биолюминесцентным методом, и при снижении активности в лимфоцитах НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ: Г6ФДГ до 0,47±0,10 мкЕ и НАДФМДГ до 1,42±0,33 мкЕ прогнозируют негладкое течение заболевания, а при повышении уровня активности НАДФГДГ до 2,97±0,53 мкЕ прогнозируют гладкое течение заболевания.