СПОСОБ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ Российский патент 2004 года по МПК A61B17/03 A61K35/36 A61K31/00 A61K33/00 

Описание патента на изобретение RU2232551C2

Способ относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использован для восстановления кожного покрова.

В литературе описан способ аутотрансплантации клеток кожи, основанный на пересадке на раневую поверхность культивированных эпителиоцитов (Rapid Amplification of Human Keratinocyte Stem Cell in Culture and Application to Skin Grafting and Reconstructive Surgery./Rheinwald J.G., O’Connell W.T., Lindberg K., Bronstein B. // J.Cell. Biochem. 1992. - Suppl.l6 F, p.120-126). Суть этого способа состоит в выращивании в культуре эпителиоцитов, с последующей их пересадкой на раневую поверхность. Существенными недостатками этого метода являются такие сложные технические проблемы, как высокая стоимость работ, необходимость специальных ростовых сред с низким содержанием кальция, многочисленный лабораторный персонал, имеющий хорошую специальную подготовку, значительные сроки получения достаточного по площади трансплантата из аутоклеток пациента (3-4 недели), что резко повышает риск развития осложнений и ухудшает прогноз.

Наиболее близким техническим решением, выбранным нами в качестве прототипа, является способ использования культивированных фибробластов при местном лечении ран, заключающийся в том, что аллофибробласты, полученные при культивировании, переносят на полупроницаемой мембране (последнее субкультивирование проводили на полупроницаемой мембране “Биофоль”) на раневую поверхность длительно незаживающих ран донорских участков, сверху трансплантат покрывают парафинизированной марлей и накладывают сухую асептическую повязку (Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики /Д.С.Саркисов, Е.В.Глущенко, Ш.Р.Гуруков, С.С.Морозов, В.П.Туманов, Н.В.Бережков//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991. - № 5. - С. 542-544). Недостатком этого способа является резкое изменение условий существования культивированных фибробластов при их переносе из условий in vitro на раневую поверхность, что отрицательно влияет на жизнедеятельность этих клеток и вызывает гибель не менее восьмидесяти процентов пересаженных клеток при применении этого способа. Причем не исключается вероятность развития реакции отторжения трансплантата, имеющая место в ряде случаев. Этот метод эффективен только в случае, когда в ране сохраняются придатки кожи, и в сочетании с аутопластикой перфорированными кожными лоскутами. Покрытие трансплантата парафинизированной марлей, с наложенной сверху асептической повязкой вызывает травмирование раневой поверхности при движениях тела и при смене повязки, а также затрудняет отток раневого отделяемого и наблюдение за реципиентной поверхностью.

Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков восстановления эпидермального покрова при отсутствии на раневой поверхности источников регенерации эпидермиса, а также закрытие при дефиците донорских ресурсов меньшим объемом донорской кожи большей площади дефекта.

Сущность заключается в том, что в заявляемом способе суспензию клеток кожи и их кластеров, полученную сразу после механической и последующей ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимающее ложе реципиента и выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 часов, за которые клетки кожи осаждаются под действием гравитации и прикрепляются к раневой поверхности за счет собственной адгезивности, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере-изоляторе, постоянно заполненной сменяемыми стерильными водными растворами с химиотерапевтическими средствами до формирования рогового слоя эпидермиса. В результате предотвращается значительное уменьшение количества клеток на этапе подготовки клеток к трансплантации, что происходит в прототипе: во-первых, при получении первичной культуры (не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro); во-вторых, при перемещении клеток из культуральной среды на реципиентную поверхность (значительная часть клеток не способна адаптироваться ко второму изменению условий существования). Клетки в заявляемом способе быстро адаптируются на раневой поверхности и активно ее покрывают за счет распластывания, миграции и пролиферации. Присутствие всех типов клеток в суспензии обеспечивает адекватное межклеточное взаимодействие и способствует быстрой регенерации наружного покрова, причем источником регенерации кожи являются трансплантированные клетки, что позволяет при дефиците донорских ресурсов меньшим объемом донорской кожи закрывать обширные посттравматические или послеожоговые дефекты наружного покрова.

Менее благоприятное для приживления воспринимающее ложе, представленное поверхностной фасцией или жировой клетчаткой, не является препятствием для использования данного способа. Раневая поверхность полностью изолирована от внешней среды, что предотвращает вторичное инфицирование, отсутствие парафинизированной марли, прилежащей к реципиентной поверхности, исключает ее травмирование. Сменяемый раствор создает благоприятные условия для регенерации и позволяет вводить в полость капсулы лекарственные средства и биологически активные вещества, активно воздействуя на ход восстановительных процессов и микрофлору в области трансплантации. Пролиферация пересаженных клеток на раневой поверхности позволяет исключить использование в растворах сыворотки и факторов роста, что способствует удешевлению данного способа.

В доступной нам литературе по биологии и медицине сведения о таком способе аутотрансплантации клеток кожи не обнаружены, что позволяет считать заявленное изобретение соответствующим критерию “новизна”.

Пример 1

У двенадцати белых крыс-самцов линии “Вистар”, массой 160 г под нембуталовым наркозом в стерильных условиях проводилось иссечение полнослойного лоскута кожи с подкожно-жировой клетчаткой до поверхностной фасции, площадью 24 кв.см на боковой поверхности тела. Затем животное укладывалось на противоположный от повреждения бок и с помощью нитей-держалок, поднимались и фиксировались в вертикальном положении края раны. Края раны были подняты с таким расчетом, чтобы обнаженные ткани дна раны было возможно полностью покрыть слоем жидкости (воспрепятствовать стеканию растворов). Далее в образованную емкость с помощью шприца заливалась среда 199. В это время из удаленного лоскута кожи выделялся участок площадью 2 кв.см. Проводилось удаление подкожно-жировой клетчатки, а затем механическим путем участок собственно кожи измельчался до размеров эксплантантов 1 куб.мм. Далее эти эксплантанты помещались в 4 мл раствора коллагеназы (Препарат “Коллализин”, производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток и Предприятия по производству бактериальных препаратов) в концентрации 250 Ед./мл в среде 199, с температурой 36° Цельсия. При постоянном встряхивании пробирки с раствором, ферментативная дезагрегация тканей продолжалась 25 минут, затем на реципиентную поверхность через сетку с размерами ячеек не пропускающими, заметные на глаз эксплантанты, производили сливание суспензии клеток и их кластеров. В пробирку с эксплантантами снова наливали раствор коллагеназы и подобным образом проводили ферментную дезагрегацию эксплантантов кожи с дальнейшим помещением суспензии клеток на раневую поверхность. Приданное в начале эксперимента положение крысы с покрытием суспензией клеток реципиентной поверхности поддерживали у 6 крыс в течение 5 часов, а у других 6 животных на протяжении 24 часов, во втором случае проводилось дополнительное парентеральное введение нембутала. Далее реципиентная поверхность у всех крыс заключалась в специальную камеру-изолятор постоянно заполненную сменяемыми стерильными водными растворами с химиотерапевтическими средствами до формирования рогового слоя эпидермиса. В качестве раствора использовали следующий солевой раствор: NaCl - 6,38 г, CaCl2 - 0,182 г, MgSO4×7HO - 0,13 г, KHCO3 - 0,4 г, NaHCO3 - 2,18 г, MgCl2×6H2O - 0,1 г, Na2HPO4×7H2O - 0,3 г, вода до 1000 г. Раствор стерилизовали автоклавированием при давлении 1 атм 20 мин. Перед использованием в 1 л раствора добавлялись: метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг. Периодичность смены раствора составляла 1 раз в 3 часа круглосуточно. В конце 5 сут после трансплантации практически вся раневая поверхность была покрыта эпидермисом, происходило формирование базальной мембраны. Эпидермис многослойный, разделения на слои еще не произошло. К 12 сут происходит кератинизация эпидермальных клеток и формирование рогового слоя. На этот срок снимали камеру и прекращали воздействие раствора. Происходило полное функциональное восстановление эпидермального покрова.

Пример 2

У 6 белых крыс-самцов линии “Вистар”, массой 160 г под нембуталовым наркозом, с соблюдением правил асептики, проводилось иссечение полнослойного лоскута кожи, площадью 24 кв.см на боковой поверхности тела. Затем животное укладывалось на противоположный от повреждения бок и с помощью нитей-держалок, поднимались и фиксировались в вертикальном положении края раны. После чего в созданную емкость с помощью шприца заливалась среда 199. В это время удаленный лоскут кожи натягивался на поверхность специального столика, и с помощью дерматома получали свободный расщепленный трансплантат, из которого выделяли участок площадью 5 кв.см. Далее механическим путем этот выделенный участок измельчался до размеров эксплантантов 1 куб.мм. Далее эти эксплантанты помещались в 5 мл раствора коллагеназы (Препарат “Коллализин”, производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток и Предприятия по производству бактериальных препаратов) в концентрации 250 Ед./мл в среде 199, с температурой 36° Цельсия.

При постоянном встряхивании пробирки с раствором, ферментативная дезагрегация тканей продолжалась 25 минут, затем на реципиентную поверхность, удерживая заметные на глаз эксплантанты, производили сливание суспензии клеток и их кластеров. В пробирку с эксплантантами снова наливали раствор коллагеназы и подобным образом проводили ферментную дезагрегацию оставшихся эксплантантов кожи с дальнейшим помещением суспензии клеток на раневую поверхность. Положение крысы на боку с покрытием суспензией клеток реципиентной поверхности поддерживали у всех крыс в течение 8 часов, при этом строго следили за постоянным покрытием реципиентной поверхности средой 199 со взвесью клеток. Поддержание реципиентной поверхности в горизонтальном положении не менее 6-8 часов очевидно достаточно для надежного закрепления значительного количества пересаживаемых клеток. Далее реципиентная поверхность у всех крыс также заключалась в специальную камеру-изолятор (где эта поверхность занимала преимущественно вертикальное положение). Полость камеры-изолятора была постоянно заполнена сменяемым 8 раз в сутки стерильным водным раствором с химиотерапевтическими средствами (состав описан в примере 1) до формирования рогового слоя эпидермиса и восстановления его функциональных свойств, что происходит через 10-12 сут после трансплантации клеток.

Похожие патенты RU2232551C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ВРЕМЕННОГО ЗАКРЫТИЯ РАНЕВОЙ ПОВЕРХНОСТИ АУТОМЕЗОТЕЛИЦИТАМИ САЛЬНИКА 2006
  • Ковалев Алексей Вячеславович
  • Васильев Виктор Владимирович
  • Иванищук Петр Петрович
RU2315573C2
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА 2003
  • Ковалев А.В.
  • Иванищук П.П.
RU2234312C1
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА У ТЯЖЕЛООБОЖЖЕННЫХ 1991
  • Малахов С.Ф.
  • Терских В.В.
  • Васильев А.В.
  • Парамонов Б.А.
  • Волошин А.В.
  • Мымрина И.А.
  • Парамонова Н.М.
RU2010028C1
Способ восстановления кожного покрова 2019
  • Зубрицкий Владислав Феликсович
  • Фоминых Евгений Михайлович
  • Лебедева Юлия Николаевна
  • Васильев Андрей Валентинович
  • Суханов Юрий Владимирович
  • Роговая Ольга Сергеевна
RU2731313C1
СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОЖИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ 1998
  • Ковалев А.В.
  • Иванищук П.П.
  • Васильев В.В.
RU2169537C2
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА 1999
  • Парамонов Б.А.
  • Потокин И.Л.
  • Блинова М.И.
  • Юдинцева Н.М.
  • Карпухина Л.Г.
  • Патрова М.Я.
  • Кудояров М.Ф.
RU2148970C1
СПОСОБ КОЖНОЙ АУТОПЛАСТИКИ 2017
  • Богданов Сергей Борисович
  • Порханов Владимир Алексеевич
  • Гилевич Ирина Валериевна
  • Федоренко Татьяна Владимировна
  • Коломийцева Елена Анатольевна
RU2657202C1
РАСТВОР ДЛЯ КРИОПРЕЗЕРВАЦИИ КОЖИ И РОГОВИЦЫ 2001
  • Смирнов С.В.
  • Киселев И.В.
  • Емельянов А.В.
  • Лешневский А.В.
  • Васильев А.В.
  • Терский В.В.
RU2212792C2
ПОДЛОЖКА ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭПИДЕРМИСА 1992
  • Островский Александр Александрович[By]
  • Никитин Василий Семенович[By]
RU2029562C1
КОМПОЗИЦИОННЫЙ ЭКВИВАЛЕНТ ЖИВОЙ КОЖИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ТЕСТ-НАБОР 1991
  • Марк Эйсенберг
RU2135191C1

Реферат патента 2004 года СПОСОБ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и хирургии. Сущность способа: суспензию клеток и их кластеров, полученную сразу после механической и ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимающее ложе реципиента, предварительно покрытое средой 199, затем выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 часов, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере, постоянно заполненной периодически сменяемым стерильным раствором, имеющим состав: NaCl - 6,38 г, CaCl2 - 0,182 г, MgSO4 × 7H2O - 0,13 г, КНСО3 - 0,4 г, NaHCO3 - 2,18 г, MgCl2 × 6H2O - 0,1 г, Na2HPO4 × 7H2O - 0,3 г, вода до 1000 г, в раствор добавляют метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг на 1 литр, область трансплантации выдерживают в растворе до формирования рогового слоя эпидермиса. Способ позволяет сократить сроки восстановления кожного покрова и обеспечивает закрытие раневых дефектов меньшим объемом донорской кожи.

Формула изобретения RU 2 232 551 C2

Способ аутотрансплантации клеток кожи на раневую поверхность, отличающийся тем, что суспензию клеток и их кластеров, полученную сразу после механической и ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимиающее ложе реципиента, предварительно покрытое средой 199, затем выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 ч, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере, постоянно заполненной периодически сменяемым стерильным раствором, имеющим определенный состав: NaCl 6,38 г, СаСl2 0,182 г, MgSO4·7Н2О 0,13 г, КНСО3 0,4 г, NaHCO3 2,18 г, MgCl2·6Н2O 0,1 г, Na2HPO4·7H2O 0,3 г, вода до 1000 г, в раствор добавляют метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг на 1 л, область трансплантации выдерживают в растворе до формирования рогового слоя эпидермиса.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2004 года RU2232551C2

САРКИСОВ Д.С
и др
Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины
Циркуль-угломер 1920
  • Казаков П.И.
SU1991A1
Кладка стен из фасонного кирпича 1922
  • Рачинский В.Е.
SU542A1
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА У ТЯЖЕЛООБОЖЖЕННЫХ 1991
  • Малахов С.Ф.
  • Терских В.В.
  • Васильев А.В.
  • Парамонов Б.А.
  • Волошин А.В.
  • Мымрина И.А.
  • Парамонова Н.М.
RU2010028C1
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА 1999
  • Парамонов Б.А.
  • Потокин И.Л.
  • Блинова М.И.
  • Юдинцева Н.М.
  • Карпухина Л.Г.
  • Патрова М.Я.
  • Кудояров М.Ф.
RU2148970C1
АЛЛОТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ 1997
  • Юрченко Н.Д.
  • Колокольцова Т.Д.
  • Колосов Н.Г.
  • Христо С.А.
  • Шумакова О.В.
  • Нечаева Е.А.
RU2142820C1
Способ подготовки трансплантата к пересадке 1982
  • Кузин Михаил Ильич
  • Сологуб Владимир Константинович
  • Донецкий Дмитрий Александрович
SU1102576A1
DE 4127570 A1, 25.02.1993
US 5716411 A1, 10.02.1998
US 6187743 A1, 13.02.2001
WO 9116010 A1, 27.08.1999
ИВАНИЩУК П.П
и др
Морфологические особенности заживления кожных ран в жидкой среде - 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия
Вестник Ивановской медицинской академии
Способ и аппарат для получения гидразобензола или его гомологов 1922
  • В. Малер
SU1998A1

RU 2 232 551 C2

Авторы

Ковалев А.В.

Иванищук П.П.

Даты

2004-07-20Публикация

2002-01-08Подача