СПОСОБ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ Российский патент 2004 года по МПК A61B17/03 A61K35/36 A61K31/00 A61K33/00 

Способ относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использован для восстановления кожного покрова.

В литературе описан способ аутотрансплантации клеток кожи, основанный на пересадке на раневую поверхность культивированных эпителиоцитов (Rapid Amplification of Human Keratinocyte Stem Cell in Culture and Application to Skin Grafting and Reconstructive Surgery./Rheinwald J.G., O’Connell W.T., Lindberg K., Bronstein B. // J.Cell. Biochem. 1992. - Suppl.l6 F, p.120-126). Суть этого способа состоит в выращивании в культуре эпителиоцитов, с последующей их пересадкой на раневую поверхность. Существенными недостатками этого метода являются такие сложные технические проблемы, как высокая стоимость работ, необходимость специальных ростовых сред с низким содержанием кальция, многочисленный лабораторный персонал, имеющий хорошую специальную подготовку, значительные сроки получения достаточного по площади трансплантата из аутоклеток пациента (3-4 недели), что резко повышает риск развития осложнений и ухудшает прогноз.

Наиболее близким техническим решением, выбранным нами в качестве прототипа, является способ использования культивированных фибробластов при местном лечении ран, заключающийся в том, что аллофибробласты, полученные при культивировании, переносят на полупроницаемой мембране (последнее субкультивирование проводили на полупроницаемой мембране “Биофоль”) на раневую поверхность длительно незаживающих ран донорских участков, сверху трансплантат покрывают парафинизированной марлей и накладывают сухую асептическую повязку (Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики /Д.С.Саркисов, Е.В.Глущенко, Ш.Р.Гуруков, С.С.Морозов, В.П.Туманов, Н.В.Бережков//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991. - № 5. - С. 542-544). Недостатком этого способа является резкое изменение условий существования культивированных фибробластов при их переносе из условий in vitro на раневую поверхность, что отрицательно влияет на жизнедеятельность этих клеток и вызывает гибель не менее восьмидесяти процентов пересаженных клеток при применении этого способа. Причем не исключается вероятность развития реакции отторжения трансплантата, имеющая место в ряде случаев. Этот метод эффективен только в случае, когда в ране сохраняются придатки кожи, и в сочетании с аутопластикой перфорированными кожными лоскутами. Покрытие трансплантата парафинизированной марлей, с наложенной сверху асептической повязкой вызывает травмирование раневой поверхности при движениях тела и при смене повязки, а также затрудняет отток раневого отделяемого и наблюдение за реципиентной поверхностью.

Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков восстановления эпидермального покрова при отсутствии на раневой поверхности источников регенерации эпидермиса, а также закрытие при дефиците донорских ресурсов меньшим объемом донорской кожи большей площади дефекта.

Сущность заключается в том, что в заявляемом способе суспензию клеток кожи и их кластеров, полученную сразу после механической и последующей ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимающее ложе реципиента и выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 часов, за которые клетки кожи осаждаются под действием гравитации и прикрепляются к раневой поверхности за счет собственной адгезивности, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере-изоляторе, постоянно заполненной сменяемыми стерильными водными растворами с химиотерапевтическими средствами до формирования рогового слоя эпидермиса. В результате предотвращается значительное уменьшение количества клеток на этапе подготовки клеток к трансплантации, что происходит в прототипе: во-первых, при получении первичной культуры (не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro); во-вторых, при перемещении клеток из культуральной среды на реципиентную поверхность (значительная часть клеток не способна адаптироваться ко второму изменению условий существования). Клетки в заявляемом способе быстро адаптируются на раневой поверхности и активно ее покрывают за счет распластывания, миграции и пролиферации. Присутствие всех типов клеток в суспензии обеспечивает адекватное межклеточное взаимодействие и способствует быстрой регенерации наружного покрова, причем источником регенерации кожи являются трансплантированные клетки, что позволяет при дефиците донорских ресурсов меньшим объемом донорской кожи закрывать обширные посттравматические или послеожоговые дефекты наружного покрова.

Менее благоприятное для приживления воспринимающее ложе, представленное поверхностной фасцией или жировой клетчаткой, не является препятствием для использования данного способа. Раневая поверхность полностью изолирована от внешней среды, что предотвращает вторичное инфицирование, отсутствие парафинизированной марли, прилежащей к реципиентной поверхности, исключает ее травмирование. Сменяемый раствор создает благоприятные условия для регенерации и позволяет вводить в полость капсулы лекарственные средства и биологически активные вещества, активно воздействуя на ход восстановительных процессов и микрофлору в области трансплантации. Пролиферация пересаженных клеток на раневой поверхности позволяет исключить использование в растворах сыворотки и факторов роста, что способствует удешевлению данного способа.

В доступной нам литературе по биологии и медицине сведения о таком способе аутотрансплантации клеток кожи не обнаружены, что позволяет считать заявленное изобретение соответствующим критерию “новизна”.

Пример 1

У двенадцати белых крыс-самцов линии “Вистар”, массой 160 г под нембуталовым наркозом в стерильных условиях проводилось иссечение полнослойного лоскута кожи с подкожно-жировой клетчаткой до поверхностной фасции, площадью 24 кв.см на боковой поверхности тела. Затем животное укладывалось на противоположный от повреждения бок и с помощью нитей-держалок, поднимались и фиксировались в вертикальном положении края раны. Края раны были подняты с таким расчетом, чтобы обнаженные ткани дна раны было возможно полностью покрыть слоем жидкости (воспрепятствовать стеканию растворов). Далее в образованную емкость с помощью шприца заливалась среда 199. В это время из удаленного лоскута кожи выделялся участок площадью 2 кв.см. Проводилось удаление подкожно-жировой клетчатки, а затем механическим путем участок собственно кожи измельчался до размеров эксплантантов 1 куб.мм. Далее эти эксплантанты помещались в 4 мл раствора коллагеназы (Препарат “Коллализин”, производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток и Предприятия по производству бактериальных препаратов) в концентрации 250 Ед./мл в среде 199, с температурой 36° Цельсия. При постоянном встряхивании пробирки с раствором, ферментативная дезагрегация тканей продолжалась 25 минут, затем на реципиентную поверхность через сетку с размерами ячеек не пропускающими, заметные на глаз эксплантанты, производили сливание суспензии клеток и их кластеров. В пробирку с эксплантантами снова наливали раствор коллагеназы и подобным образом проводили ферментную дезагрегацию эксплантантов кожи с дальнейшим помещением суспензии клеток на раневую поверхность. Приданное в начале эксперимента положение крысы с покрытием суспензией клеток реципиентной поверхности поддерживали у 6 крыс в течение 5 часов, а у других 6 животных на протяжении 24 часов, во втором случае проводилось дополнительное парентеральное введение нембутала. Далее реципиентная поверхность у всех крыс заключалась в специальную камеру-изолятор постоянно заполненную сменяемыми стерильными водными растворами с химиотерапевтическими средствами до формирования рогового слоя эпидермиса. В качестве раствора использовали следующий солевой раствор: NaCl - 6,38 г, CaCl₂ - 0,182 г, MgSO₄×7HO - 0,13 г, KHCO₃ - 0,4 г, NaHCO₃ - 2,18 г, MgCl₂×6H₂O - 0,1 г, Na₂HPO₄×7H₂O - 0,3 г, вода до 1000 г. Раствор стерилизовали автоклавированием при давлении 1 атм 20 мин. Перед использованием в 1 л раствора добавлялись: метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг. Периодичность смены раствора составляла 1 раз в 3 часа круглосуточно. В конце 5 сут после трансплантации практически вся раневая поверхность была покрыта эпидермисом, происходило формирование базальной мембраны. Эпидермис многослойный, разделения на слои еще не произошло. К 12 сут происходит кератинизация эпидермальных клеток и формирование рогового слоя. На этот срок снимали камеру и прекращали воздействие раствора. Происходило полное функциональное восстановление эпидермального покрова.

Пример 2

У 6 белых крыс-самцов линии “Вистар”, массой 160 г под нембуталовым наркозом, с соблюдением правил асептики, проводилось иссечение полнослойного лоскута кожи, площадью 24 кв.см на боковой поверхности тела. Затем животное укладывалось на противоположный от повреждения бок и с помощью нитей-держалок, поднимались и фиксировались в вертикальном положении края раны. После чего в созданную емкость с помощью шприца заливалась среда 199. В это время удаленный лоскут кожи натягивался на поверхность специального столика, и с помощью дерматома получали свободный расщепленный трансплантат, из которого выделяли участок площадью 5 кв.см. Далее механическим путем этот выделенный участок измельчался до размеров эксплантантов 1 куб.мм. Далее эти эксплантанты помещались в 5 мл раствора коллагеназы (Препарат “Коллализин”, производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток и Предприятия по производству бактериальных препаратов) в концентрации 250 Ед./мл в среде 199, с температурой 36° Цельсия.

При постоянном встряхивании пробирки с раствором, ферментативная дезагрегация тканей продолжалась 25 минут, затем на реципиентную поверхность, удерживая заметные на глаз эксплантанты, производили сливание суспензии клеток и их кластеров. В пробирку с эксплантантами снова наливали раствор коллагеназы и подобным образом проводили ферментную дезагрегацию оставшихся эксплантантов кожи с дальнейшим помещением суспензии клеток на раневую поверхность. Положение крысы на боку с покрытием суспензией клеток реципиентной поверхности поддерживали у всех крыс в течение 8 часов, при этом строго следили за постоянным покрытием реципиентной поверхности средой 199 со взвесью клеток. Поддержание реципиентной поверхности в горизонтальном положении не менее 6-8 часов очевидно достаточно для надежного закрепления значительного количества пересаживаемых клеток. Далее реципиентная поверхность у всех крыс также заключалась в специальную камеру-изолятор (где эта поверхность занимала преимущественно вертикальное положение). Полость камеры-изолятора была постоянно заполнена сменяемым 8 раз в сутки стерильным водным раствором с химиотерапевтическими средствами (состав описан в примере 1) до формирования рогового слоя эпидермиса и восстановления его функциональных свойств, что происходит через 10-12 сут после трансплантации клеток.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и хирургии. Сущность способа: суспензию клеток и их кластеров, полученную сразу после механической и ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимающее ложе реципиента, предварительно покрытое средой 199, затем выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 часов, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере, постоянно заполненной периодически сменяемым стерильным раствором, имеющим состав: NaCl - 6,38 г, CaCl₂ - 0,182 г, MgSO₄ × 7H₂O - 0,13 г, КНСО₃ - 0,4 г, NaHCO₃ - 2,18 г, MgCl₂ × 6H₂O - 0,1 г, Na₂HPO₄ × 7H₂O - 0,3 г, вода до 1000 г, в раствор добавляют метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг на 1 литр, область трансплантации выдерживают в растворе до формирования рогового слоя эпидермиса. Способ позволяет сократить сроки восстановления кожного покрова и обеспечивает закрытие раневых дефектов меньшим объемом донорской кожи.

Способ аутотрансплантации клеток кожи на раневую поверхность, отличающийся тем, что суспензию клеток и их кластеров, полученную сразу после механической и ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимиающее ложе реципиента, предварительно покрытое средой 199, затем выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 ч, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере, постоянно заполненной периодически сменяемым стерильным раствором, имеющим определенный состав: NaCl 6,38 г, СаСl₂ 0,182 г, MgSO₄·7Н₂О 0,13 г, КНСО₃ 0,4 г, NaHCO₃ 2,18 г, MgCl₂·6Н₂O 0,1 г, Na₂HPO₄·7H₂O 0,3 г, вода до 1000 г, в раствор добавляют метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг на 1 л, область трансплантации выдерживают в растворе до формирования рогового слоя эпидермиса.