СПОСОБ ПРЯМОГО ИНГИБИРОВАНИЯ КАСПАЗ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/99 C07D293/00 

Изобретение относится к биохимии, в частности к усовершенствованному способу прямого ингибирования цистеиновых аспартат-специфичных протеаз (каспаз).

Изобретение может быть использовано в биохимии, клеточной биологии, физиологии и фармакологии для изучения и направленной регуляции процессов, связанных с индукцией, развитием и/или предотвращением программированной клеточной гибели (апоптоза), а также для исследования строения и механизма действия каспаз.

В настоящее время установлено, что апоптоз в клетках животных и человека в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз - семейства цистеиновых протеаз, катализирующих расщепление субстратов после остатков аспарагиновой кислоты (G.M.Cohen "Caspases: the executioners of apoptosis" Biochem. J., 1997. v.326, pt.l, p. 1-16 [1]; N.A.Thornberry, Y.Lazebnik "Caspases: enemies within" Science 1998, v.281(5381), p.1312-1316 [2]; Y.Shi "Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis" Mol. Cell 2002, v.9, №3, p.459-470 [3]).

В зависимости от гомологии и субстратной специфичности выделяют три основные группы каспаз: 1) протеазы, вовлеченные в процесс воспаления (каспазы 1, 4, 5 и 13); 2) так называемые инициирующие или сигнальные (каспазы 6 и 8-10) и 3) эффекторные протеазы (каспазы 2, 3, 7). Каспаза-3 играет одну из ключевых ролей в осуществлении программированной клеточной гибели различных типов клеток. Соединения, ингибирующие данный фермент, обладают цитопротекторным действием и рассматриваются как потенциальные фармакологические средства для лечения инфаркта миокарда, церебральной ишемии, болезни Альцгеймера, остеоартрита, цирроза печени и других заболеваний (напр., T.Rudel "Caspase inhibitors in prevention of apoptosis" Herz, 1999, v.24, №3, p.236-241 [4]; N.Guttenplan, C.Lee, W.H.Frishman "Inhibition of myocardial apoptosis as a therapeutic target in cardiovascular disease prevention: focus on caspase inhibition" Heart Dis., 2001, v.3, №5, p.313-318 [5]; H.J.Rideout, L.Stefanis "Caspase inhibition: a potential therapeutic strategy in neurological diseases" Histol. Histopathol., 2001, v.16, №3, p.895-908 [6]).

В многочисленных исследованиях для изучения возможного участия каспаз в определенных физиологических процессах, в частности в апоптозе, применяют известные способы специфического ингибирования данных ферментов с помощью различных низкомолекулярных соединений.

Так, с указанной целью широко применяются производные олигопепетидов, содержащих реакционноспособные группировки, такие как альдегидная, галоидметилкетонная и др. (например, [4]).

Несмотря на определенную специфичность и эффективность ингибирующего действия соединений данного класса в условиях in vitro в физиологических и фармакологических исследованиях они нашли ограниченное применение по целому ряду причин, основными из которых являются плохая биодоступность при пероральном введении.

В настоящее время проводится поиск соединений других классов, способных эффективно снижать активность каспаз.

Известен способ ингибирования каспаз путем введения в среду, содержащую данные ферменты, N,N,N′,N′-тетраэтилтиурамдисульфида (дисульфирама) формулы I

(C₂H₅)₂N-C(S)S-SC(S)-N(C₂H₅)₂ (I)

(C.S.Nobel, M.Kimland et al. "Disulfiram is a potent inhibitor of proteases of the caspase family" Chem. Res. Toxicol., 1997, v.10, №12, p.1319-1324 [7]).

Указанный способ при использовании 10 мкМ дисульфирама позволяет снизить активность каспазы-3 ~ на 70%.

Описан способ ингибирования каспазы-3 путем введения в среду (препарат из печени мышей), содержащую фермент, 1-(4-аминофенил)метил-3-(3-нитрофенил)-1,3-дигидроимидазо[4,5-b]пиридин-2-она (ZNC-2381) формулы II

(Y.Segawa, N.Tsuzuike et al. "Effects of a novel hepatoprotective drug, ZNC-2381, on fasinduced hepatocellular caspase-3 activity and apoptosis in mice" Pharmacology, 2001, v.62, №2, p.80-86 [8])

Данный способ при использовании 10 мкМ ZNC-2381 приводит к снижению активности каспазы-3 на 41,6%.

Известны аннелированные производные 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы III

где, если Х = С-О-СН₃, СС(O)СН₃, C-NO₂ или N, то R = С₆Н₅, или, если Х = СН, то R - карбоксиметил; незамещенный фенил или фенил, содержащий в положении 4 атом хлора, нитро-, карбокси- или (С_1-4-алкил)оксикарбонильную группу; α-метилбензил; α-метил-[(низший алкил)оксикарбонил]метил; пиридил или (пиридил)метил, и их биохимически приемлемые соли, обладающие определенными биохимическими или физиологическими свойствами или полученные в качестве продуктов химического синтеза (G.Mugesh, W.W.du Mont, H.Sies "Chemistry of biologically important synthetic organoselenium compounds" Chem. Rev. 2001, v.101, №7, p.2125-2179 [9]).

Показано, что 2-фенил-1,2-бензизоселеназол-3-он (эбселен) формулы III, где Х = СН, R - фенил, ингибирует активацию каспазы-3 в эндотелиальных клетках аорты быка и желудочковых кардиомиоцитах крысы под действием доксорубицина и обладает антиоксидантными свойствами (S.Kotamraju, E.A.Konorev et al. "Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species" J. Biol. Chem. 2000, v.275, №43, p.33585-33592 [10]), а также в альвеольных макрофагах под действием кремния (H.M.Shen, Z.Zhang et al. "Reactive oxygen species and caspase activation mediate silica-induced apoptosis in alveolar macrophages" Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2001, v.280, №1, p.L10-17 [11]).

Прямое ингибирующее действие эбселена и других соединений общей формулы III на каспазы, в частности на каспазу-3, не исследовано. Известно, что ингибирование активации каспаз может быть опосредовано различными механизмами, не связанными с прямым действием на фермент. Так, показано, что ингибиторы сериновых протеаз ингибируют активацию (процессинг) каспаз (3,8,9) в результате блокирования протеолитического расщепления прокаспаз (3,8,9), не влияя (в концентрации до 200 мкМ) на каталитическую активность самих каспаз (Z.Dong, P.Saikumar et al. "Serine protease inhibitors suppress cytochrome c-mediated caspase-9 activation and apoptosis during hypoxia-reoxygenation" Biochem. J. 2000, v.347, pt.3, p.669-677 [12]). Аналогичным действием обладает аминогуанидин, снижающий активность NO-синтазы и диаминоксидазы (T.Okamoto, S.Okabe "Inhibition of anti-Fas antibody-induced hepatitis by aminoguanidine in mice" Eur. J. Pharmacol. 2000, v.403, №3, p.277-280 [13]). Кроме этого, ингибирование активации каспаз, в частности каспазы-3, может быть вызвано влиянием и других биологически активных веществ на различные звенья молекулярных механизмов апоптоза.

Наиболее близким к описываемому является известный способ ингибирования каспаз (преимущественно каспазы-3 и каспазы-7) путем введения в среду, содержащую активированные каспазы, производных изатина, в том числе соединения формулы IV

где R = СН₃ и R¹= (патенты США №6214858, 514/418, oп.2001 г. [14]; №6403792, 544/144, oп. 2002 г. [15]; D.Lee, S.A.Long et al. "Potent and selective nonpeptide inhibitors of caspases 3 and 7" J. Med. Chem. 2001, v.44, №12, p.2015-2026 [16] - прототип).

Несмотря на высокую эффективность вышеуказанного способа при ингибировании гомогенной рекомбинантной каспазы-3 (IC₅₀=3,1 нМ), при добавлении цитозоля хондроицитов в среду инкубации согласно приведенным данным [16] активность указанного соединения снижалась в 160 раз (IC₅₀ = 7,5±3,5 мкМ). Описанный эффект авторы объяснили неспецифическим взаимодействием данного производного изатина с другими белками.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего более эффективно ингибировать каспазы в присутствии других белков.

Указанная задача решается с помощью описываемого способа прямого ингибирования каспаз путем введения бициклического азотсодержащего соединения в среду, содержащую активированные каспазы, отличающегося тем, что в качестве бициклического азотсодержащего соединения вводят аннелированное производное 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы III, где R и Х имеют указанные значения, или его биохимически приемлемую соль (например, ацетат, сукцинат, гемисукцинат, малеат, цитрат, сульфат, гемисульфат, гидрохлорид и др. при наличии в составе молекулы пиридильного фрагмента или натриевую, калиевую, аммониевую, [трис(гидроксиметил)метил]аммониевую и др. при наличии в составе молекулы карбоксильной группы).

Описываемый способ прямого ингибирования каспаз позволяет более эффективно снижать активность данных ферментов в присутствии других белков.

Аннелированные производные изоселеназол-3-она общей формулы III, где R и Х имеют указанные значения, получают известным способами, заключающимся в том, что соответствующую ортоаминобензойную кислоту диазотируют и обрабатывают диселенидом натрия или литированием бензамидов с последующим взаимодействием с селеном [9].

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Ингибирующее действие аннелированных изоселеназол-3-онов общей формулы I на каспазы печени крыс.

В работе использовали крыс линии Вистар средней массой 180-200 г. Для активации каспазы-3 животным вводили внутрибрюшинно бактериальный липополисахарид из E.coli в дозе 20 мкг/кг. Через 12 ч после инъекции крыс декапитировали и проводили перфузию печени через портальную вену 0,9% раствором NaCl. В дальнейшем печень гомогенизировали в 5 объемах буфера (100 мМ HEPES, рН 7,4, 140 мкМ NaCl, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, по 10 мкг/мл апротинина, пепстатина и лейпептина) и центрифугировали 30 мин при 13000 g при 4°С. Полученный супернатант использовали для определения активности каспаз с помощью специфических субстратов.

Показано, что печень животных содержит каспазы-1 (ICE), 3, 7 и другие изоформы, причем каспаза-3 находится преимущественно в цитозоле гепатоцитов, в то время как каспаза-7 ассоциирована почти исключительно с митохондриальной и микросомальной фракциями. При индукции апоптоза каспаза-7 активируется и транслоцируется в эндоплазматический ретикулум (N.Rouquet, J.С.Pages et al. "ICE inhibitor YVADcmk is a potent therapeutic agent against in vivo liver apoptosis" Curr. Biol. 1996, v.6, №9, p.l 192-1195 [17]; J.M.Chandler, G.M.Cohen, M.MacFarlane "Different subcellular distribution of caspase-3 and caspase-7 following Fas-induced apoptosis in mouse liver" J. Biol. Chem. 1998, v.273, №18, p. l0815-10818 [18]).

Активность каспазы-3 и 7 определяли известным спектрофотометрическим способом с использованием (N-ацетил-L-аспартил)-L-глутамил-L-валил-L-аспарагиновой кислоты п-нитроанилида (Ac-DEVD-pNa) в качестве субстрата (R.V.Talanian, C.Quinlan et al. "Substrate specificities of caspase family proteases" J. Biol. Chem. 1997, v.272, №15, p.9677-9682 [19]).

Супернатант печени (400 мкг белка) инкубировали 1 ч при 37°С в 100 мМ HEPES, рН 7,4, содержащем 200 мкМ Ac-DEVD-pNa и 0,1% CHAPS. Реакцию останавливали, охлаждая пробы на льду. Для осаждения нерастворившихся компонентов пробы центрифугировали при 13000 g 10 мин при 4°С. Абсорбцию pNa, образовавшегося в результате ферментативного расщепления Ac-DEVD-pNa, измеряли при 405 нм. Аналогичным образом определяли активность каспазы-1 с использованием в качестве субстрата (N-ацетил-L-тирозил)-L-валил-L-аланил-L-аспарагиновой кислоты п-нитроанилида (Ac-YVAD-pNa) [19].

Исследуемые соединения растворяли в воде (при необходимости добавляли ДМСО до конечной концентрации 10% в пробе). Полученные растворы соединений инкубировали с супернатантами печени в вышеуказанном буфере. Влияние соединений на активность каспаз печени крыс определяли при двух способах инкубации - с предварительной инкубацией с супернатантами печени при комнатной температуре в течение 30 мин и без предварительной инкубации. В дальнейшем активность каспаз-3 и 7 определяли вышеописанным способом. В качестве известного ингибитора фермента (для контроля) использовали 5 мкМ Ac-DEVD-CHO.

Определение белка в пробах осуществляли по методу Бредфорда.

Полученные результаты показывают, что исследуемые аннелированные производные изоселеназол-3-она при конечной концентрации в пробах, равной 1-100 мкМ, в описанных условиях оказывают ингибирующее действие на активность каспаз печени крыс. Так, активность каспазы-3 (частично дополненная активностью перешедшей в цитозоль каспазы-7) в условиях без предварительной инкубации в присутствии 10 мкМ эбселена составила 9,86±0,90% от исходного значения. В результате предварительной инкубации в течение 30 мин при 22°С ингибирующее действие данного соединения незначительно усилилось (активность каспазы-3 + частично каспазы-7 составляла 7,53±2,5% от исходного значения). Согласно способу-прототипу активность каспазы-3 в присутствии 7,5±3,5 мкМ производного изатина и других белков цитозоля хондроицитов составляла 50%.

5-Нитроизатин, который согласно известным данным [16] снижал активность очищенной каспазы-3 (IC₅₀=3 мкМ), в вышеописанных условиях проявлял значительно более слабые ингибирующие свойства (IC₅₀~100 мкМ). Это соответствует опубликованным данным о существенном уменьшении ингибирующей активности производных изатина в присутствии цитозоля хондроицитов, содержащего другие белки.

Таким образом, описываемый способ ингибирования каспаз (в частности, каспазы-3) с помощью соответствующих аннелированных производных 1,2-изоселеназол-3-она позволяет эффективно снижать активность данного класса протеаз в присутствии других белков.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается ингибирования цистеиновых аспартат-специфичных протеаз (каспаз), и может быть использовано в биохимии, клеточной биологии, физиологии и фармакологии для изучения и направленной регуляции процессов, связанных с индукцией, развитием и/или предотвращением программированной клеточной гибели (апоптоза), а также для исследования строения и механизма действия каспаз. Способ осуществляют введением в среду, содержащую активированные каспазы, аннелированного производного 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы [I], где, если Х = С-О-СН₃, СС(O)СН₃, C-NO₂ или N, то R = С₆Н₅, или, если Х = СН, то R - карбоксиметил; незамещенный фенил или фенил, содержащий в положении 4 атом хлора, нитро-, карбокси- или (С_1-4-алкил)оксикарбонильную группу; α-метилбензил; α-метил-[(низший алкил)оксикарбонил]метил; пиридил или (пиридил)метил, или его биохимически приемлемую соль. Изобретение позволяет эффективно снижать активность данных ферментов в присутствии других белков (для наиболее близкого известного производного изатина IC₅₀ = 7,5±3,5 мкМ; в присутствии соединений, применяемых в описываемом способе, в частности в 10 мкМ 2-фенил-1,2-бензизоселеназол-3-оне, активность каспазы-3 (+ каспазы-7) составляла 7,53±2,5% от исходного значения.

Способ прямого ингибирования каспаз путем введения бициклического азотсодержащего соединения в среду, содержащую активированные каспазы, отличающийся тем, что в качестве бициклического азотсодержащего соединения вводят аннелированное производное 1,2-изоселеназол-3-она общей формулы

где, если Х = С-О-СН₃, СС(O)СН₃, C-NO₂ или N, то R = С₆Н₅, или, если Х = СН, то R -карбоксиметил; незамещенный фенил или фенил, содержащий в положении 4 атом хлора, нитро-, карбокси- или (С_1-4-алкил)оксикарбонильную группу; α-метилбензил; α-метил-[(низший алкил)оксикарбонил]метил; пиридил или (пиридил)метил,

или его биохимически приемлемую соль.