ПОЛИПЕПТИД 1106, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК Н 1106, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД 1106, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РН 1106, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД 1106, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА 1106 Российский патент 1997 года по МПК C12N15/48 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и представляет собой гибридный полипептид, состоящий из полипептида, продукта фрагмента гена pol-вируса иммунодефицита человека I-го типа (ВИЧ-1) и β-галактозидазы E. coli, синтезируемый бактериальным штаммом E. coli, несущим рекомбинантную плазмиду, имеющую в своем составе клонированный фрагмент гена pol ВИЧ-1, ответственный за синтез интегразы (intl) слитный с геном b-галактозидазы E. coli и связывающийся с антителами к продуктам этого гена, что позволяет проводит серодиагностику синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

СПИД возникает в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ при попадании в организм поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Заболевание характеризуется длительным (от 2 до 10 лет) бессимптомным периодом, в течение которого в крови инфицированного определяются только антитела к вирусным белкам, затем следует прогрессирующая деградация иммунной и центральной нервной системы, поэтому для проведения экстренных противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного начала лечения ВИЧ-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять инфицированных ВИЧ на ранних этапах инфекции.

Многочисленные исследования позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. В настоящее время известно два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), имеющих сходную организацию генома и различающихся по антигенной структуре вирусных белков.

ВИЧ имеет наиболее сложное из всех ретровирусов строение генома. Помимо генов gag, pol u env, направляющих синтез основных вирионных белков и общих для всех ретровирусов, геном ВИЧ-1 содержит еще шесть генов: vif, tat, rev (или art, или trs), 3'-nef, vpr u vpu. Геном ВИЧ-2 в отличие от ВИЧ-1, не содержит гена vpu, но содержит ген vpx (Science, 1986, 231, p. 1549; Cell, 198, 46, p. 807 817).

Интеграза фермент, необходимый для встраивания провирусной ДНК в геном зараженных клеток, кодируется С-концевым участком гена pol ВИЧ. Этот белок ВИЧ относительно инвариантен у различных вирусных изолятов и антитела на него обнаруживаются у значительного числа пациентов, зараженных ВИЧ.

Большинство методов диагностики ВИЧ-инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в сыворотках крови и других биологических жидкостях (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлюоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации.

Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных белков ВИЧ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВИЧ, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе.

При этом существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВИЧ, и в частности гена env (патент ЕПВ N 0265 785, кл. C 12 N 15/00, 1986; ЕПВ N 0 270 114, кл. C 12 N 15/00, 1986; ЕПВ N 0276 591, кл. C 12 N 15/00, 1986 и др.).

В настоящее время ведется поиск полипептидов наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики СПИД. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕВП N 0265 785, кл. C 12 N 15/00, 1986; РСТ N 89/03878, кл. C 12 N 15/00, 1989), так и в направлении выбора наиболее антигенноактивных детерминант (ЕВП, NN 0306219 и 0311228, кл. C 12 N 15/00, 1986 и 1987 соответственно) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВИЧ (РСТ N 91/05864, кл. C 12 N 15/48, 1989; УВП N 0361749, кл. C 12 N 15/48, 1989).

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный полипептид I106, продукт фрагмента генома ВИЧ-1, связывающий антитела к интегразе, продукту гена pol ВИЧ-1; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид I106 и входящий в состав рекомбинантной плазмиды pHI106; штамм E. coli, ВКПМ N B-5874, содержащий рекомбинантную плазмиду pHI106 и экспрессирующий белок I106.

Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^oC колонии клеток гладкие, круглые, блестящие бледножелтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30 32^oC колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37^oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага l проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при 30 32 ^oC. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39 42^oC. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага l составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1•10⁸. кл/мл. Белок стабилен при 4^oC в течение 3 4 мес.

Рекомбинантный полипептид I106, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, интроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена pol ВИЧ-1 в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов N 5874.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК HI106.

У ВИЧ-инфицированного человека отбирают из вены 10 мл гепаринизированной крови, к которой добавляют 30 мл лизирующего раствора (155 mM NH₄Cl; 10 mM KHCO₃; 0,1 mM EDTA). Смесь инкубируют 15 мин на льду. Центрифугируют при 2000 G 10 мин при 4^oC. Белые клетки ресуспендируют в 10 мл SE (75 mM NaCl, 2 mM EDTA) добавляют протеиназу K до конечной концентрации 100 мкг/мл и 1 мл 20% SDS. Смесь инкубируют 4 ч при 37^oC, добавляют 1/2 объема (5 мл) водонасыщенного фенола и такое же количество хлороформа с изоамиловым спиртом (24: 1). Полученную смесь встряхивают на качалке 15 мин и центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин. К отобранной водной фазе добавляют 1/30 объема NaOAc (pH 5,5) и равный объем изопропилового спирта. ДНК осаждают центрифугированием и промывают 70-ным раствором этилового спирта. Осадок ДНК растворяют в буфере TE (10 mM Трис-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

В эппендорфовскую пробирку на 0,5 мл вносят следующие компоненты: деионизированная вода 43,5 мкл; реакционный буфер 10 мкл • 10 (конечная концентрация 25 mM Трис-HCl, pH 8,3 [при 25^oC] 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM b-меркаптоэтанол, желатин 200 мкг/мл); смесь dNTP 16 мкл (конечная концентрация 200 мкМ); праймер Nl 5'-CGTCTTGGGCCTTGTCGGATCC-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ); праймер N2 5'-CTGCAGCTCATCCTGTCTACTT-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ); ДНК (матрица для амплификации) 10 мкл (конечная концентрация 1 нг); Taq-полимеразу 0,5 мкл (2,5 ед. на пробу).

Содержимое пробирки перемешивают на вортексе 3 4 с и осаждают на микроцентрифуге в течение 5 10 с.

В пробирку добавляют 50 мкл минерального масла и помещают в аппарат для амплификации ДНК N 801 0177 DNA Thermal Cycler Perkin-Elmer Corporation.

Реакционную смесь инкубируют при 94^oC 7 мин, а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 2 мин при 37,198>C (гибридизация праймеров); 5 мин при 72^oC (достройка праймеров); 2 мин при 94^oC (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72^oC 10 мин.

В пробирку вносят 50 мкл хлороформа, материал с хлороформом встряхивают 5 с на вортексе, а затем центрифугируют на микроцентрифуге 10 с. После этого отбирают водную (верхнюю) фазу (около 100 мкл), которая образуется в форме сферической капли, и переносят в чистую пробирку.

10 мкл водной фазы используют для анализа продуктов амплификации в 2-ном агарозном геле с бромистым этидием (виден фрагмент 860 п.н.).

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК HI106.

Пример 2. Получение плазмиды pHI106.

Синтезированный на ДНК-матрице фрагмент ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буфере для рестрикции (10 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl и 1 mM дитиотрейтол pH 7,5) в течение 14 ч при 37^oC. Ферменты инактивируют нагреванием при 70^oC 15 мин. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл H₂O. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК помещают в эппендорфовскую пробирку, содержащую 3 мл лигазного буфера (50 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM дитиотрейтол, 1,0 mM АТФ, 50 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 2 мкл (0,2 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pEL5C, обработанной рестриктазами BamHI и PstI и 4 мкл H₂O. К смеси добавляют 1 мкл (100 ед.) Т4 ДНК лигазы и инкубируют 3 ч при 16^oC.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLN90 по обычной методике (Molecular cloning. New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB-агаром, содержащие 25 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазой BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 1%-ном агарозе.

Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HI106 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 860 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК. При определении нуклеотидной последовательности плазмиды pHI106 установлено, что синтезированный нами фрагмент гена pol ВИЧ-1 через BamHI сайт присоединен к 3'-концу гена β-галактозидазы E.coli.

Пример 3. Штамм E.coli HI106, содержащий плазмиду pHI106, выращивают в 100 мл среды LB при 30 ^oC до плотности 1 • 10 кл/мл. После этого температуру повышают до 37^oC и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Natuer, 227, 680 685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLT90, содержащий векторную плазмиду pEL5C и не содержащий полученную нами плазмиду pHI106. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli HI106, содержащий плазмиду pHI106, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 145 155 кД. Этот полипептид назван I106. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность b-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента провирусной ДНК ВИЧ-2 представлена ниже:

слитный с β-галактозидазой E.coli.

Пример 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны BH85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24B, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3-ной TXY в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15M NaCl, 20 mM Трис-HCl, pH 7,4) с 0,5% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37^oC обрабатывают сывороткой, содержащей антитела к вирусу ВИЧ-1, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^oC в течение 1 ч. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки, реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1M Трис-HCl, pH 8,0).

Анализ показывает, что полипептид I106 связывается с антителами к вирусу иммунодефицита человека первого типа.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет определять антитела к продуктам гена pol-ВИЧ-1 с высокой эффективностью и специфичностью, а сам процесс определения не требует работы с высокоинфекционным вирусным материалом.

Использование: биотехнология, генная инженерия и иммунология. Сущность изобретения: предлагается гибридный полипептид 1106, состоящий из полипептида, способного связывать антитела к продукту гена pol ВИЧ-1, и β-галактозидазы E. coli. Гибридный полипептид синтезируется бактериальным штаммом Escherichia coli ВКПМ NB-5874. Штамм получен в результате трансформации плазмидной ДНК pH 1106, несущей фрагмент гена pol ВИЧ-1. 4 с. п. ф-лы.

1. Полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, полученный в штамме бактерий Escherichia coli ВКПМ N В-5874, трансформированном рекомбинантной плазмидой ДНК рН1106, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий полипептид со следующей аминокислотной последовательностью I (см.стp )
слитый с βгалактозидазой E.coli, и обладающий способностью связывать антитела к продукту гена polВИЧ-1, с молекулярной массой 145 155 кДа при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле. 2. Фрагмент ДНК Н1106, кодирующий полипептид 1106, полученный с помощью цепной реакции полимеризации с нуклеотидной последовательностью II (см.стp. )
содержащий на 3'-конце стоп-кодон. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК рН1106, кодирующая полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека, размером 7260 п.о. содержащая;
Bam HI-PstI фрагмент ДНК вектора pEL5C, включающий ген bгалактозидазы E. coli, размером 6400 п.о.

PstI-BamHI фрагмент ДНК Н1106, кодирующий полипептид 1106, размером 860 п.о.

по одному участку расщепления рестриктазами BamHI, PstI, Sma III,
промотор бактериофага лямбда cro LacZ,
генетические маркеры: Amp^r ген устойчивости к ампициллину.