ПРОИЗВОДНЫЕ ИНДОЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТАГОНИСТОВ МСР-1 Российский патент 2004 года по МПК C07D209/42 C07D401/06 C07D403/04 A61K31/404 A61K31/4196 A61K31/475 A61P29/00 

Настоящее изобретение относится к противовоспалительным соединениям, которые действуют посредством антагонизма рецептора CCR2 (известного так же, как рецептор МСР-1), приводя, наряду с другими эффектами, к ингибированию моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1). Эти соединения содержат индольный фрагмент. Изобретение, кроме того, относится к содержащим их фармацевтическим композициям, способам их получения, промежуточным соединениям, полезным при их получении, и к их применению в качестве терапевтических средств.

МСР-1 является членом семейства хемокинов провоспалительных белков, которые опосредуют хемотаксис и активацию лейкоцитов. МСР-1 представляет собой С-С хемокин, который является одним из наиболее мощных и избирательных из известных хемоаттрактантов и активирующих средств Т-клеток и моноцитов. МСР-1 причастен к патофизиологии огромного числа воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит, гломерулонефриты, фиброз легких, рестеноз (Международная патентная заявка WO 94/09128), альвеолит (Jones et al., 1992, J. Immunol., 149, 2147) и астму. Другими патологическими процессами, при которых, как считают, МСР-1 играет роль в их патологии, являются атеросклероз (например, Koch et al., 1992, J. Clin. Invest., 90, 772-779), псориаз (Deleuran et al., 1996, J. Dermatological Science, 13, 228-236), кожные реакции гиперчувствительности замедленного типа, воспалительное заболевание кишечника (Grimm et al., 1996, J. Leukocyte Biol., 59, 804-812), рассеянный склероз и травма головного мозга (Berman et al., 1996, J. Immunol., 156, 3017-3023). Ингибитор МСР-1 может быть полезен для лечения инсульта, реперфузионного повреждения, ишемии, инфаркта миокарда и отторжения трансплантата.

МСР-1 действует через рецептор CCR2. МСР-2 и МСР-3 могут также, по крайней мере частично, действовать через данный рецептор. Поэтому, когда в данном описании упоминается “ингибирование или антагонизм МСР-1” или “эффекты, опосредованные МСР-1”, это включает ингибирование или антагонизм в отношении эффектов, опосредованных МСР-2 и/или МСР-3, когда МСР-2 и/или МСР-3 действуют через рецептор CCR2.

Заявители обнаружили класс соединений, содержащих индольный фрагмент, которые обладают полезной ингибирующей активностью против МСР-1. Находящаяся одновременно на рассмотрении заявка UK 9716657.3 раскрывает класс индолов с ингибирующей активностью в отношении МСР-1. Данная заявка основана на удивительном открытии того, что конкретные замещенные 5-гидроксииндолы являются ингибиторами МРС-1, которые обладают неожиданными и благоприятными свойствами в отношении мощности и/или уровнями в крови и/или биологической доступности и/или растворимости.

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет соединения формулы (I):

в которой

R¹ представляет водород, галоген или метокси;

R² представляет водород, галоген, метил, этил или метокси;

R³ представляет карбокси, тетразолил или -CONHSO₂R⁴, где R⁴ представляет метил, этил, фенил, 2,5-диметилизоксазолил или трифторметил;

Т представляет -СН₂- или -SO₂; и

кольцо А представляет 3-хлорфенил, 4-хлорфенил, 3-трифторметилфенил, 3,4-дихлорфенил, 3,4-дифторфенил, 3-фтор-4-хлорфенил, 3-хлор-4-фторфенил или 2,3-дихлорпирид-5-ил; или их фармацевтически приемлемые соли или пролекарства.

В данном описании термин “алкил” включает алкильные группы как с прямыми, так и с разветвленными цепями, но ссылки на отдельные алкильные группы, такие как “пропил”, специфичны только для прямоцепочечных вариантов. Термин “галоген” относится к фтору, хлору, брому и иоду.

Конкретные новые соединения изобретения включают, например, соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли или пролекарства, в которых при отсутствии других указаний:

а) R¹ имеет любое из значений, определенных здесь ниже в пунктах i)-iii), или комбинацию двух из этих значений;

b) R² имеет любое из значений, определенных здесь ниже в пунктах iv)-viii), или комбинацию двух из этих значений;

c) R³ имеет любое из значений, определенных здесь ниже в пунктах ix)-xi), или комбинацию двух из этих значений;

e) Т имеет любое из значений, определенных здесь ниже в пунктах xii)-xiii);

f) кольцо А имеет любое из значений, определенных здесь ниже в пунктах xiv)-xxi), или комбинацию двух из этих значений;

i) R¹ представляет водород;

ii) R¹ представляет галоген;

iii) R¹ представляет метокси;

iv) R² представляет водород;

v) R² представляет галоген;

vi) R² представляет метил;

vii) R² представляет этил;

viii) R² представляет метокси;

ix) R³ представляет карбокси;

х) R³ представляет тетразолил;

xi) R³ представляет -CONHSO₂R⁴, где R⁴ представляет метил этил, фенил, 2,5-диметилизоксазолил или трифторметил;

xii) Т представляет -СН₂-;

xiii) Т представляет -SO₂-;

xiv) кольцо А представляет 3-хлорфенил;

xv) кольцо А представляет 4-хлорфенил;

xvi) кольцо А представляет 3-трифторметилфенил;

xvii) кольцо А представляет 3,4-дихлорфенил;

xviii) кольцо А представляет 3,4-дифторфенил;

xix) кольцо А представляет 3-фтор-4-хлорфенил;

хх) кольцо А представляет 3-хлор-4-фторфенил; и

xxi) кольцо А представляет 2,3-дихлорпирид-5-ил.

Предпочтительно R¹ представляет водород.

Предпочтительно R² представляет водород.

Предпочтительно R³ представляет карбоксильную группу.

Предпочтительно Т представляет -СН₂-.

Предпочтительно кольцо А представляет 3-хлорфенил, 4-хлорфенил, 3-трифторметилфенил, 3,4-дихлорфенил, 3,4-дифторфенил, 3-фтор-4-хлорфенил или 3-хлор-4-фторфенил.

Более предпочтительно, кольцо А представляет 3,4-дихлорфенил, 3-фтор-4-хлорфенил или 3-хлор-4-фторфенил.

Например, кольцо А представляет 3,4-дихлорфенил или 3-хлор-4-фторфенил.

В другом аспекте изобретения предпочтительно кольцо А представляет 3,4-дихлорфенил, 2,3-дихлорпирид-5-ил или 3-хлор-4-фторфенил.

Поэтому в предпочтительном аспекте изобретения предоставляются соединения формулы (I), изображенной выше, в которой:

R¹ представляет водород;

R² представляет водород;

R³ представляет карбокси;

Т представляет -СН₂-; и

кольцо А представляет 3,4-дихлорфенил, 3-фтор-4-хлорфенил или 3-хлор-4-фторфенил; в частности, 3,4-дихлорфенил или 3-хлор-4-фторфенил; или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

Предпочтительные соединения изобретения включают любое соединение примеров. Более предпочтительными соединениями изобретения являются соединения примеров 1, 3 и 4, например, примера 1 и 3.

Изобретение далее относится ко всем таутомерным формам соединений формулы (I).

Следует также понимать, что некоторые соединения формулы (I) могут существовать в сольватированной, а также несольватированной формах, таких, например, как гидратированные формы. Следует также понимать, что изобретение охватывает все такие сольватированные формы.

Соединения формулы (I) являются ингибиторами хемоаттрактантного белка-1 моноцитов. Кроме того, они по-видимому ингибируют хемотаксис, вызванный RANTES. RANTES (регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками) представляет еще один хемокин из того же семейства, что и МСР-1, с аналогичным биологическим профилем, но действующий через рецептор CCR-1. В результате эти соединения могут применяться для лечения заболеваний, опосредованных этими агентами, в частности, воспалительных заболеваний.

Подходящие фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I) включают соли оснований, такие как соли щелочных металлов, например, натрия, соли щелочноземельных металлов, например, кальция или магния, соль органического амина, например, триэтиламина, морфолина, N-метилпиперидина, N-этилпиперидина, прокаина, дибензиламина, N,N-дибензилэтиламина или аминокислоты, например, лизина. В другом аспекте, когда соединение является достаточно основным, подходящие соли включают кислотно-аддитивные соли, такие как метансульфонат, фумарат, гидрохлорид, гидробромид, цитрат, малеат и соли, образованные с фосфорной и серной кислотой. Может быть несколько катионов или анионов в зависимости от количества заряженных функций и валентности катионов или анионов. Предпочтительной фармацевтически приемлемой солью является натриевая соль.

В данной области известны различные формы пролекарств. Примеры таких производных пролекарств можно найти в публикациях:

a) Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard (Elsevier, 1985) и Methods in Enzymology, Vol.42, p.309-396, edited by K. Widder, et al. (Academic Press, 1985);

b) A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen и H.Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Prodrugs", by H.Bungaard, p.113-191 (1991);

c) H.Bungaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992);

d) H.Bungaard et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); и

е) N. Kakeya, et al., Chem Pharm Bull, 32, 692 (1984).

Примерами таких пролекарств являются расщепляемые in vivo сложные эфиры соединений изобретения. Расщепляемым in vivo сложным эфиром соединения изобретения, содержащим карбоксигруппу, является, например, фармацевтически приемлемый эфир, который расщепляется в организме человека или животного с образованием исходной кислоты. Подходящие фармацевтически приемлемые эфиры для карбоксигруппы включают сложные C_1-6 алкиловые эфиры, например, метиловые или этиловый; C_1-6 алкоксиметиловые эфиры, например, метоксиметиловый; C_1-6 алканоилоксиметиловые эфиры, например, пивалоилоксиметиловый; фталидиловые эфиры; С_3-8 циклоалкоксикарбонилокси-С_1-6 алкиловые эфиры, например, 1-циклогексилкарбонилоксиэтиловый; 1,3-диоксолан-2-илметиловые эфиры, например, 5-метил-1,3-диоксолан-2-илметиловый; C_1-6 алкоксикарбонилоксиэтиловые эфиры, например, 1-метоксикарбонилоксиэтиловый; аминокарбонилметиловые эфиры и их моно- или ди-N-(С_1-6 алкиловые) варианты, например, N,N-диметиламинокарбонилметиловые эфиры и N-этиламинокарбонилметиловые эфиры; и они могут образовываться по любой карбоксигруппе в соединениях данного изобретения. Расщепляемым in vivo сложным эфиром соединения изобретения, содержащим гидроксильную группу, является, например, фармацевтически приемлемый сложный эфир, который расщепляется в организме человека или животного с получением исходной гидроксильной группы. Подходящие фармацевтически приемлемые эфиры для гидроксигруппы включают C_1-6 алканоиловые эфиры, например, ацетиловые эфиры; и бензоиловые эфиры, в которых фенильная группа может быть замещена аминометилом или N-замещенным моно- или ди-C_1-6 алкиламинометилом, например, 4-аминометилбензоиловые эфиры и 4-N,N-диметиламинометилбензоиловые эфиры.

Дополнительными примерами таких пролекарств являются расщепляемые in vivo амиды соединений изобретения. Примеры таких расщепляемых in vivo амидов включают N-C_1-6 алкиламид и N, N-ди-(С_1-6 алкил)амид, такие как N-метил, N-этил, N-пропил, N,N-диметил, N-этил-N-метил или N,N-диэтиламид.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет способ получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей или пролекарств (R¹, R², R³, Т и кольцо А имеют значения, определенные для формулы (I), если не указано иное), включает стадии:

а) реакции соединений формулы (II)

в которой R³ представляет R³ или защищенный R³, a R^b представляет водород или подходящую гидроксизащитную группу, с соединением формулы (III)

в которой L представляет смещаемую группу;

и после этого при необходимости:

i) превращения соединения формулы (I) в другое соединение формулы (I);

ii) удаления любой защитной группы; или

iii) образования его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства.

Подходящими значениями для L являются, например, галогеновая или сульфонилокси группа, например, хлор, бром, метансульфонилокси или толуол-4-сульфонилоксигруппа.

Конкретными условиями для указанных выше реакций являются следующие:

а) Соединения формулы (II) и (III) могут подвергаться реакции вместе в инертном растворителе и основании, таком как N,N-диметилформамид/гидрид натрия или дихлорметан/гидроксид натрия или ацетонитрил/карбонат калия, или в присутствии катализатора переноса фазы, такого как тетра-н-бутиламмонийгидросульфат. Реакцию подходящим образом осуществляют в течение 1-6 ч, предпочтительно 1-3 ч, при температуре 15-30° С, предпочтительно 20-25° С с получением соединения формулы (I).

Соединения формулы (II) могут быть промышленно доступными или они могут быть получены с помощью модификации с использованием известных способов получения промышленно доступных соединений формулы (II), или они могут быть получены следующими способами:

Способ i)

Реакция соединения формулы (IV):

в которой R^b имеет определенные выше значения, с соединением формулы (V)

в которой R^c представляет C_1-4 алкил.

Соединения формулы (IV) и (V) вводятся в реакцию в условиях реакции Reissert, таких как в инертном растворителе (таком как тетрагидрофуран), в присутствии основания (такого как этоксид калия), в диапазоне температур 15-30° С, предпочтительно 20-25° С, в течение 10-20 ч, предпочтительно 15-17 ч. Полученное соединение отделяют и растворяют в спирте, таком как этанол, и органической кислоте (такой как уксусная кислота) и добавляют катализатор на основе переходного металла (такой как 10% Pd/C) и циклогексен. Смесь нагревают при температуре 60-120° С, предпочтительно 70-90° С, в течение 15-25 ч, предпочтительно 16-20 ч, с получением соединения формулы (II), в которой R^a представляет -СO₂С_1-4 алкил.

Способ (ii)

Реакция соединения формулы (VI):

в которой R^b имеет определенные выше значения, с соединением формулы (VII)

в которой R^d представляет C_1-4 алкил.

Соединения формулы (VI) и (VII) вводятся в реакцию в условиях Фишера, как, например, с органической кислотой (такой как уксусная кислота), в спирте (таком как этанол) при температуре 60-90° С, предпочтительно 75-85° С, в течение 1-5 ч, предпочтительно 1-3 ч. Полученное соединение смешивают с сильной кислотой (такой как полифосфорная кислота) и нагревают при 90-150° С, предпочтительно 100-120°С, в течение 0,5-4 ч, предпочтительно 0,5-2 ч с получением соединения формулы (II), в которой R² представляет водород. Затем при желании R² может необязательно превращаться в другое значение R², определенное в формуле (I), с использованием методик, известных в данной области, таких как методики, описанные ниже.

Способ (iii)

Циклизация соединения формулы (VIII)

в которой R¹, R^a, R^b и R² представляют радикалы, определенные выше.

Циклизацию можно осуществлять с помощью кипячения соединения с обратным холодильником в органическом растворителе, таком как ксилол. Соединения формулы (VIII) подходящим образом получают по реакции соединения формулы (IX)

в которой R¹, R² и R^b имеют значения, определенные выше, с соединением формулы (X)

в которой R^a имеет значения, определенные выше. Реакцию подходящим образом проводят в органическом растворителе, таком как спирт, в частности, метанол, в присутствии основания, такого как алкоксид щелочного металла, в частности, метоксид натрия. Подходящей является умеренная температура от -30 до 20°С.

Способ (iv)

Согласно еще одной модификации соединения формулы (II) получают циклизацией соединения формулы (XI)

в которой R¹ и R^b имеют значения, определенные выше, R⁷ представляет алкил, такой как метил, а R⁸ представляет карбоксизащитную группу, такую как алкил, в частности, метил.

Циклизацию можно осуществлять в условиях Klingemann подогреванием раствора соединения в органическом растворителе, таком как толуол, и подходящей кислоте, такой как пара-толуол-сульфоновая кислота.

Соединения формулы (XI) можно получать в результате реакции соединения формулы (XII)

в которой R¹, R^b R⁵ и R⁶ имеют значения, определенные выше, с соединением формулы (XIII)

в которой R⁷ и R⁸ имеют значения, определенные выше в отношении формулы (XI). Соединение формулы (XII) можно растворять в разбавленной кислоте, такой как 1,5 н. НС1, в присутствии нитрита, такого как нитрит натрия, при умеренно низких температурах от -30 до 0°С, предпочтительно -5°С.

Затем раствор смешивают с раствором соединения формулы (XIII) в органическом растворителе, таком как этанол, в присутствии раствора основания, такого как гидроксид щелочного металла, например, водный раствор гидроксида натрия.

Соединения формулы (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (X), (XII) и (XIII) являются известными или промышленно доступными, или получаются способами, известными в данной области, с помощью стандартной манипуляции с промышленно доступными или известными материалами.

R^c и R^d представляют C_1-4 алкил. Предпочтительно R^c и R^d представляют метил или этил.

Следует также понимать, что в некоторых из упомянутых здесь реакций может быть необходимо/желательно защищать какие-либо чувствительные группы в соединениях. Случаи, при которых защита необходима или желательна, известны специалистам в данной области. Так, если реагенты включают такие группы, как карбоксильная или гидроксильная, может быть желательным защитить группу в некоторых упомянутых выше реакциях.

Подходящей защитной группой для гидроксильной группы является, например, ацильная группа, например, алканоильная группа, такая как ацетил, ароильная группа, например, бензоил, или арилметильная группа, например, бензил. Условия снятия защиты для указанных выше защитных групп необходимо будет варьировать в зависимости от выбора защитной группы. Так, например, ацильная группа, такая как алканоильная или ароильная группа, могут быть удалены, например, гидролизом подходящим основанием, таким как гидроксид щелочного металла, например, гидроксид лития или натрия. Альтернативно, арилметильная группа, такая как бензильная группа, может быть удалена, например, гидрированием на катализаторе, таком как палладий на угле.

Подходящей защитной группой для карбоксильной группы является, например, этерифицирующая группа, например, метильная или этильная группа, которые могут быть удалены, например, гидролизом основанием, таким как гидроксид натрия, или, например, трет-бутильная группа, которая может быть удалена, например, обработкой кислотой, например, органической кислотой, такой как трифторуксусная кислота, или, например, бензильная группа, которая может быть удалена, например, гидрированием на катализаторе, таком как палладий на угле.

Защитные группы могут быть удалены на любой удобной стадии синтеза с использованием обычных методик, хорошо известных в области химии.

Некоторые из описанных здесь промежуточных соединений возможно являются новыми, например, промежуточные соединения формулы (II), и они как таковые предоставляются в качестве дополнительного признака изобретения.

Когда требуется фармацевтически приемлемая соль соединения формулы (I), она может быть получена, например, реакцией указанного соединения с соответствующей кислотой (которая предоставляет физиологически приемлемый анион) или с соответствующим основанием (которое предоставляет физиологически приемлемый катион), или с помощью любой другой обычной процедуры образования соли.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, которая включает соединение формулы (I), определенное здесь выше, или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем.

Композиции изобретения могут быть в форме, подходящей для орального применения (например, таблеток, пастилок, твердых или мягких капсул, водных или масляных суспензий, эмульсий, диспергируемых порошков или гранул, сиропов или эликсиров), для местного применения (например, в виде кремов, мазей, гелей, водных или масляных растворов или суспензий), для введения ингаляцией (например, в виде тонкоизмельченного порошка или жидкого аэрозоля), для введения вдуванием (например, в виде тонкоизмельченного порошка). Или для парентерального введения (например, в виде стерильного водного или масляного раствора для внутривенного, подкожного, внутримышечного или внутрикожного введения или в виде суппозиторий для ректального введения).

Композиции изобретения могут быть получены с помощью обычных процедур с использованием обычных фармацевтических наполнителей, хорошо известных в данной области. Так, композиции, предназначенные для орального применения, могут содержать, например, одно или несколько красящих, подслащивающих, ароматизирующих и/или консервирующих средств.

Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители для образования таблеток включают, например, инертные растворители, такие как лактоза, карбонат натрия, фосфат кальция или карбонат кальция, гранулирующие и разрыхляющие средства, такие как кукурузный крахмал или алгеновая кислота; связывающие средства, такие как крахмал; смазывающие средства, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк; консервирующие средства, такие как этил- или пропил-пара-гидроксибензоат, и антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота. Композиции таблеток могут быть непокрытыми или покрытыми или для изменения их дезинтеграции и последующего всасывания активного ингредиента внутри желудочно-кишечного тракта, или для улучшения их стойкости и/или внешнего вида, с использованием обычных средств и процедур, хорошо известных в данной области.

Композиции для орального применения могут быть в форме твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым растворителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или маслом, таким как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.

Водные суспензии обычно содержат активный ингредиент в тонкоизмельченной порошкообразной форме вместе с одним или несколькими суспендирующими агентами, такими как натрий карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, смола трагаканта и смола акации; диспергирующие или смачивающие агенты, такие как лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами (например, полиоксиэтиленстеарат), или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксиэтанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, полиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов (таких как этил или пропил пара-гидроксибензоат), антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота), красящие агенты, ароматизирующие агенты и/или подслащивающие агенты (такие как сахароза, сахарин или аспартам).

Масляные суспензии могут составляться суспендированием активного ингредиента в растительном масле (таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло) или в минеральном масле (таком как жидкий парафин). Масляные суспензии могут также содержать загуститель, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подслащивающие агенты, такие как агенты, указанные выше, и ароматизаторы могут добавляться для предоставления приятного на вкус препарата. Данные композиции могут консервироваться добавлением антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии добавлением воды, обычно содержат активный ингредиент вместе с диспергирующим или смачивающим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Примеры подходящих диспергирующих или смачивающих агентов уже упомянуты выше. Могут также присутствовать дополнительные наполнители, такие как подслащивающие, ароматизирующие и красящие агенты.

Фармацевтические композиции изобретения могут также быть в форме эмульсий масло-в-воде. Масляная фаза может представлять растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, такое как, например, жидкий парафин, или смесь любых из них. Подходящими эмульгирующими агентами могут быть, например, встречающиеся в природе смолы, такие как смола акации или смола трагаканта, встречающиеся в природе фосфатиды, такие как соевые бобы, лецитин, сложные эфиры или частичные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гексита (например, сорбитан моноолеат), и продукты конденсации указанных частичных сложных эфиров с этиленоксидом, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии могут также содержать подслащивающие, ароматизирующие и консервирующие агенты.

Сиропы и эликсиры могут составляться с подслащивающими агентами, такими как глицерин, пропиленгликоль, сорбит, аспартам или сахароза, и могут также содержать смягчающее средство, консервант, ароматизатор и/или краситель.

Фармацевтические композиции могут также быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций, которая может быть составлена в соответствии с известными процедурами с использованием одного или нескольких соответствующих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов, которые были упомянуты выше. Стерильный препарат для инъекций может также представлять стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном, приемлемом для парентерального применения разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле.

Композиции суппозиторий могут быть получены смешиванием активного ингредиента с подходящим нераздражающим наполнителем, который представляет твердое вещество при обычных температурах, но жидкое вещество при ректальной температуре, и поэтому в прямой кишке расплавляется с высвобождением препарата. Подходящие наполнители включают, например, масло какао и полиэтиленгликоли.

Композиции для местного применения, такие как кремы, мази, гели и водные или масляные растворы или суспензии, могут быть обычно получены объединением активного ингредиента с обычным, приемлемым для местного применения носителем или разбавителем с использованием обычной процедуры, хорошо известной в данной области.

Композиции для введения вдуванием могут быть в форме тонкоизмельченного порошка, содержащего частицы со средним диаметром, например, 30 мкм или гораздо меньше, причем сам порошок содержит или один активный ингредиент, или разбавленный одним или несколькими физиологически приемлемыми носителями, такими как лактоза. Затем порошок для вдувания для удобства помещают в капсулу, содержащую, например, от 1 до 50 мг активного ингредиента для применения с устройством турбоингаляции, таким как устройство, используемое для вдувания известного средства кромогликата натрия.

Композиции для введения путем ингаляции могут быть в виде обычного находящегося под давлением аэрозоля, приспособленного для подачи активного ингредиента или в виде аэрозоля, содержащего мелко измельченное твердое вещество, или капельки жидкого вещества. Могут использоваться обычные аэрозольные газы-вытеснители, такие как летучие фторированные углеводороды или углеводороды, и аэрозольное устройство может быть для удобства отрегулировано для подачи дозированного количества активного ингредиента.

Дополнительную информацию о готовых формах композиций читатель может получить в главе 25.2 тома 5 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press, 1990.

Количество активного ингредиента, которое комбинируется с одним или несколькими наполнителями для получения одной дозированной лекарственной формы, необходимо варьировать в зависимости от подвергаемого лечению субъекта и от конкретного способа введения. Например, композиция, предназначенная для орального введения людям, обычно содержит, например, от 0,5 мг до 2 г активного агента, объединенного с соответствующим и удобным количеством эксципиентов или наполнителей, которое может варьировать примерно от 5 до 98 мас.% всей композиции. Дозированные лекарственные формы обычно содержат от 1 мг до около 500 мг активного ингредиента. За дополнительной информацией о способах введения и схемах дозировки читатель может обратиться к главе 25.3 тома 5 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press, 1990.

Размер дозы соединения формулы I для лечебных или профилактических целей будет, естественно, варьировать в соответствии с природой и тяжестью заболеваний, возрастом и полом животного или пациента и путем введения в соответствии с хорошо известными принципами медицины. Как указывалось выше, соединения формулы I полезны для лечения заболеваний или медицинских состояний, которые являются полностью или частично следствием эффекта фарнезилирования крыс.

При применении соединения формулы I в лечебных или профилактических целях его обычно следует вводить так, чтобы суточная доза приема составляла в диапазоне, например, от 0,5 мг до 75 мг/кг массы тела, при необходимости вводимая дробными дозами. При использовании парентерального пути обычно вводятся более низкие дозы. Так, например, для внутривенного введения обычно применяют дозу в диапазоне, например, от 0,5 мг до 30 мг/кг массы тела. Аналогичным образом, для введения ингаляцией применяется доза в диапазоне, например, от 0,5 мг до 25 мг/кг массы тела. Однако предпочтительно оральное введение.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство, определенные здесь выше, для применения в способе терапевтического лечения организма человека или животного. Как описывалось выше, изобретение предоставляет подходящий способ лечения воспалительного заболевания введением соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства или фармацевтической композиции.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является соединение формулы (I) и его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в качестве лекарственного средства.

Данное соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство предназначены для применения в качестве лекарственного средства для антагонизма действию, опосредуемому МСР-1, у теплокровного животного, такого как человек.

Таким образом, в соответствии с еще одним аспектом изобретения, предоставляется применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства в производстве лекарственного средства для проявления антагонизма действию, опосредуемому МСР-1, у теплокровного животного, такого как человек.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения, предоставляется способ оказания антагонизма действию, опосредуемому МСР-1, у теплокровного животного, такого как человек, нуждающегося в таком лечении, который включает введение указанному животному эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, определенных здесь выше.

Биологические испытания

Следующие способы биологического испытания, данные и примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения.

Сокращения:

АТСС American Type Culture Collection, Rockville, USA (Американская коллекция типов культур)

ВСА Бицинхрониновая кислота (используемая с сульфатом меди для анализа белка)

BSA Бычий сывороточный альбумин

DMEM Среда Игла, модифицированная по Дульбекко

EGTA Этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусная кислота

FCS Плодная сыворотка теленка

HEPES (N-[2-Гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновая кислота])

HBSS Сбалансированный солевой раствор Хенкса

hMCP-1 Человеческий моноцитарный хемоаттрактантный белок-1

PBS Солевой раствор с фосфатным буфером

PCR Полимеразная цепная реакция

В качестве источника теплостойкой ДНК полимеразы используют AMPLITAQ™ , поставляемый фирмой Perkin-Elmer Cetus.

Связывающий буфер представляет 50 мМ HEPES, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ MgCl₂, 0,5% плодной телячьей сыворотки, доведенный до рН 7,2 с помощью 1 М NaOH.

Заменимыми аминокислотами (концентрат 100Х) являются L-аланин, 890 мг/л; L-аспарагин, 1320 мг/л; L-аспарагиновая кислота, 1330 мг/л; L-глутаминовая кислота, 1470 мг/л; глицин, 750 мг/л; L-пролин, 1150 мг/л и L-серин, 1050 мг/л.

Добавка гипоксантина и тимидина (концентрат 50х) представляет собой гипоксантин, 680 мг/л, и тимидин, 194 мг/л.

Пенициллин-стрептомицин представляет: Пенициллин G (натриевая соль); 5000 ед/мл; стрептомицинсульфат 5000 мкг/мл.

Клетки линии человеческих моноцитарных клеток ТНР-1 доступны в АТСС под номером АТСС TIB-202.

Сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) получали от Gibco; см. Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1949, 71, 196.

Синтетическую среду для клеточных культур, RPMI 1640, получали у Gibco; она содержит неорганические соли [Са(NО₃)₂·_{4Н2O 100 мг/л; КСl 400 мг/л; MgSO4·7H2O 100 мг/л; NaCl 6000 мг/л; NaHCO3 2000 мг/л и Na2HPO4 (ангидрид) 800 мг/л], D-глюкозу 2000 мг/л, восстановленный глутатион 1 мг/л, аминокислоты и витамины.}

FURA-2/AM представляет пентаацетоксиметиловый эфир 1-[2-(5-карбоксиоксазол-2-ил)-6-аминобензофуран-5-окси]-2-(2'-амино-5'-метилфенокси)-этан-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и его получали у Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA.

Буфер для осаждения крови содержит 8,5 г/л NaCl и 10 г/л гидроксиэтилцеллюлозы.

Буфер для лизиса представляет 0,15 М NH₄Cl^-, 10 мМ КНСО₃, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота).

Связывающий буфер цельных клеток представляет 50 мМ HEPES, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ MgCl₂, 0,5% BSA, 0,01% NaN₃, pH доведен до 7,2 1М NaOH.

Буфер для промывки представляет 50 мМ HEPES, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ MgCl₂, 0,5% FCS, инактивированной теплом, 0,5М NaCl, pH доведен до 7,2 1М NaOH.

Можно следовать общим процедурам молекулярной биологии по любому из способов, описанных в руководстве "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

i) Клонирование и экспрессия рецептора hMCP-1

кДНК рецептора В МСР-1 (CCR2B) клонируют с помощью PCR из РНК клеток ТНР-1 с использованием подходящих олигонуклеотидных праймеров на основании опубликованных данных о последовательностях рецептора МСР-1 (Charo et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2752). Полученные продукты PCR клонируют в вектор PCR-II™ (InVitrogen, San Diego, CA). Свободную от ошибок кДНК CCR2B субклонируют в качестве фрагмента Hind III-Not I в эукариотный вектор экспрессии pCDNA3 (InVitrogen) для получения соответственно pCDNA3/CC-CKR2A и pCDNA3/CCR2B.

Линеаризованную ДНК pCDNA3/CCR2B трансфектируют в клетки СНО-К1 преципитацией фосфатом кальция (Wigler et al., 1979, Cell, 16, 777). Трансфектированные клетки собирают добавлением генетицинсульфата (G418, Gibco BRL) в концентрации 1 мг/мл через 24 ч после трансфекции клеток. Получение РНК и Northern блоттинг осуществляют, как описано ранее (Needham et al., 1995, Prot.Express.Purific., 6, 134). Клон 7 CHO-K1 (CHO-CCR2B) идентифицируют как наиболее высокий экспрессор рецептора В МСР-1.

ii) Получение фрагментов мембран

Клетки CHO-CCR2B выращивают в DMEM с добавлением 10% плодной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1х ненезаменимых аминокислот, 1х гипоксантина и тимидиновой добавки и пенициллина-стрептомицина (в концентрации 50 мкг стрептомицина/мл, Gibco BRL). Фрагменты мембран получают с использованием способов лизиса клеток/дифференциального центрифугирования, описанных ранее (Siciliano et al., 1990, J. Biol.Chem., 265, 19658). Концентрацию белка оценивают с помощью анализа белка ВСА (Pierce, Rockford, Illinois) в соответствии с инструкциями изготовителя.

iii) Анализ

 ¹²⁵I МСР-1 получают с использованием конъюгации Bolton и Hunter (Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc.]. Анализы равновесного связывания проводят с использованием способа Ernst et al., 1994, J. Immunol., 152, 3541. Вкратце, добавляют варьируемые количества МСР-1, меченого ¹²⁵I, к 7 мкг очищенных мембран клеток CHO-CCR2B в 100 мкл связывающего буфера. После 1 ч инкубации при комнатной температуре смеси реакции связывания фильтруют и промывают 5 раз через промывочный планшет (Brandel MLR-96T Cell Harvester) с использованием холодного буфера связывания. Прокладки для фильтров (Brandel GF/B) перед использованием предварительно вымачивают в течение 60 мин 0,3% полиэтиленимина. После фильтрования отдельные фильтры отделяют в пробирки емкостью 3,5 мл (Sarstedt №55484) и определяют связанный МСР-1, меченый ¹²⁵I (LKB 1277 Gammamaster). Исследования холодовой конкуренции проводят, как указано выше, с использованием 100 пкмоль МСР-1, меченого ¹²⁵I, в присутствии различных концентраций немеченого МСР-1. Неспецифическое связывание определяют включением 200-кратного молярного избытка немеченого МСР-1 в реакции.

Исследования связывания лигандов с фрагментами мембран, полученными из клеток CHO-CCR2B, показали, что рецептор CCR2B присутствует в концентрации 0,2 пкмоль/мг белка мембраны и селективно и с высоким сродством связывает МСР-1 (IС₅₀=110 пкмоль, К_d=120 пкмоль). Связывание с этими мембранами полностью обратимо и достигает равновесия через 45 мин при комнатной температуре, и имеется линейная связь между связыванием МСР-1 и концентрацией мембран CHO-CCR2B при использовании МСР-1 в концентрации от 100 пкмоль до 500 пкмоль.

Испытуемые соединения, растворенные в ДМСО (5 мкл), испытывались при конкуренции со 100 пкмоль меченого МСР-1 в диапазоне концентрации (0,01-50 мкмоль) с использованием восьмиточечных кривых зависимости реакции от дозы и вычислялись концентрации IC₅₀.

Испытанные соединения настоящего изобретения имеют величины IС₅₀ 50 мкмоль или менее в описанном здесь анализе связывания рецептора hMCP-1.

b) Опосредованный МСР-1 ток кальция в клетках ТНР-1

Клеточную линию моноцитов человека ТНР-1 выращивают в синтетической среде для клеточных культур RPMI 1640 с добавлением 10% плодной телячьей сыворотки, 6 мМ глутамина и пенициллина-стрептомицина (при концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, Gibco BRL). Клетки ТНР-1 промывают в HBSS (лишенном Са²⁺иМg²⁺)+1 мг/мл BSA и ресуспендируют в таком же буфере при плотности 3× 10⁶ клеток/мл. Затем клетки загружают 1 мМ FURA-2/AM на 30 мин при 37° С, дважды промывают в HBSS и ресуспендируют при плотности 1× 10⁶ клеток/мл. Суспензию клеток ТНР-1 (0,9 мл) добавляют в одноразовую кювету емкостью 5 мл, содержащую магнитную мешалку в виде палочки и 2,1 мл предварительно подогретого (37° С) HBSS, содержащего 1 мг/мл BSA, 1 мМ MgCl₂ и 2 мМ CaCl₂. Кювету помещают во флюоресцентный спектрофотометр (Perkin Elmer, Norwalk, CT) и предварительно инкубируют в течение 4 мин при 37° С при перемешивании. Флюоресценцию регистрируют в течение 70 с и клетки стимулируют добавлением в кювету через 10 с hMCP-1. [Са²⁺]i измеряют возбуждением попеременно при 340 нм и 380 нм и последующим измерением интенсивности флюоресцентной эмиссии при 510 нм. Рассчитывают и подают на дисплей соотношение интенсивности испускаемого флюоресцентного излучения после возбуждения при 340 нм и 380 нм, (R), и оценивают цитоплазматический [Ca²⁺] в соответствии с уравнением:

где K_d для комплекса FURA-2 Са²⁺при 37°С принимают за 224 нм. R_max представляет максимальное соотношение флюоресценции, определенное после добавления 10 мМ иономицина, R_min представляет минимальное соотношение, определенное последующим добавлением свободного от Са²⁺ раствора, содержащего 5 мМ EGTA (этиленгликольтетрауксусной кислоты), a Sf2/Sb2 представляет соотношение величин флюоресценции при возбуждении 380 нм, определенных соответственно при R_mах и R_min.

Стимуляция клеток ТНР-1 hMCP вызывает быстрый, преходящий подъем [Са²⁺] i специфическим образом и в зависимости от дозы. Кривые зависимости реакции от дозы показывают приблизительную величину ЕС₅₀ 2 нм. Испытываемые соединения, растворенные в ДМСО (10 мкл), количественно анализируют на ингибирование высвобождения кальция добавлением их в клеточную суспензию за 10 с перед добавлением лиганда и измерением уменьшения преходящего подъема [Ca²⁺li. Испытуемые соединения также проверяют на отсутствие агонистической активности добавлением вместо hMCP-1.

с) Хемотаксис, опосредованный hMCP-1 и RANTES

Количественные анализы хемотаксиса in vitro проводят с использованием клеточной линии человеческих моноцитов ТНР-1. Миграцию клеток через поликарбонатные мембраны измеряют подсчетом проходящих клеток или непосредственно с помощью счетчика Coulter, или косвенно с использованием калориметрического анализа жизнеспособности измерением расщепления соли тетразолия митохондриальной респираторной цепью (Scudiero D.A., et al., 1988, Cancer Res., 48, 4827-4833).

Хемоаттрактанты вносят в 96-луночную микротитровочную планшету, которая образует нижний колодец камеры хемотаксиса, снабженной обрамленной поликарбонатным клеем фильтровальной мембраной без поливинилпирролидона (PVP) с размером пор 5 мкм (NeuroProbe MB series, Cabin John, MD 20818, USA), в соответствии с инструкциями производителя. Хемоаттрактант соответствующим образом разводят в синтетической среде для клеточной культуры, RPMI 1640 (Gibco) или с добавлением 2 мМ глутамина и 0,5% BSA, или альтернативно HBSS с Са²⁺и Мg²⁺ без Phenol Red (Gibco) плюс 0,1% BSA. Каждое разведение дегазируют в вакууме в течение 30 мин и помещают (400 мкл) в нижние ячейки камеры, клетки ТНР-1 (5× 10⁵ в 100 мкл RPMI 1640+0,5% BSA) инкубируют в каждой ячейке верхней камеры. Для ингибирования хемотаксиса хемоаттрактант держат при постоянной субмаксимальной концентрации, определенной предварительно (1 нМ МСР-1) и добавляют в нижнюю ячейку вместе с испытуемыми соединениями, растворенными в ДМСО (конечная концентрация ДМСО <0,05% об./об.) при различных концентрациях. Камеру инкубируют в течение 2 ч при 37° С в 5% СО₂. Среду удаляют из верхних лунок, затем вымывают 200 мкл физиологического солевого раствора перед открытием камеры, вытиранием насухо поверхности мембраны и центрифугированием 96-луночной планшеты при 600 g в течение 5 мин для сбора клеток. Надосадочную жидкость (150 мкл) аспирируют и обратно в ячейки добавляют 10 мкл реагента клеточной пролиферации, WST-1, {4-[3-(4-иодфенил)-2-(4-нитрофенил)-2Н-5-тетразолио]-1,3-фенилдисульфонат} плюс реагент электронного сопряжения (Boehringer Manheim, Cat.no.1644 807). Планшету инкубируют при 37° С в течение 3 ч и спектральную поглощательную способность растворимого формазанового продукта считывают на считывающем устройстве микротитровочных планшет при 450 нм. Данные вводят в электронную динамическую таблицу с поправкой на какую-либо случайную миграцию в отсутствие хемоаттрактанта и вычисляют средние величины спектральной поглощательной способности, стандартной ошибки среднего и критерии статистической значимости различий. hMCP-1 вызывает зависимую от концентрации миграцию клеток с характерной двухфазной реакцией, максимальной при 0,5-1,0 нм.

При альтернативной форме указанного выше количественного анализа могут использоваться меченные флюоресцентной меткой клетки для того, чтобы способствовать окончательной детекции. В этом случае используемые клетки ТНР-1 метят флюоресцентной меткой инкубацией в присутствии 5 мМ Calcein AM (глицин, сложный N,N'-[[3',6'-бис(ацетилокси)-3-оксоспиро[изобензофуран-1(3Н),9'-[9Н]ксантол]-2',1'-диил]бис(метилен)]бис[N-[2-[(ацетилокси)метокси] -2-оксоэтил]] -бис [(ацетилокси) метиловый] эфир; Molecular Probes) в течение 45 мин в темноте. Клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в HBSS (без фенола красного) с Са²⁺, Mg²⁺и 0,1% BSA. 50 мкл (2× 105 клеток) клеточной суспензии помещают на фильтр над каждой ячейкой и, как указано выше, блок инкубируют при 37° С в течение 2 ч в атмосфере 5% СO₂. В конце инкубации клетки вымывают с верхней поверхности фильтра солевым раствором с фосфатным буфером, фильтр удаляют с планшеты, и количество клеток, привлеченных или к нижней стороне фильтра, или в нижнюю лунку, оценивают считыванием величины флюоресценции при возбуждении при 485 нм, при длине волн испускаемого излучения 538 нм (fmax, Molecular Devices). Данные вводят в электронную динамическую таблицу с поправкой на какую-либо случайную миграцию в отсутствие хемоаттрактанта и рассчитывают средние величины флюоресценции, стандартной ошибки среднего, процентную долю ингибирования и IC⁵⁰ испытуемых соединений, и можно рассчитать критерии статистической значимости различий. В дополнение к хемотаксису, вызванному МСР-1, данную альтернативную форму анализа используют также для измерения ингибирования хемотаксиса, вызванного RANTES (2 нМ).

d) Связывание с мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMCs)

i) Получение человеческих PBMCs

Свежую человеческую кровь (200 мл) получают у доноров-добровольцев, собирают натрийцитратный антикоагулянт с получением конечной концентрации 0,38%. Кровь смешивают с буфером осаждения и инкубируют при 37° С в течение 20 мин. Надосадочную жидкость собирают и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 5 мин (Sorvall RT6000D). Полученный осадок после центрифугирования ресуспендируют в 20 мл RPMI/BSA (1 мг/мл) и 4× 5 мл клеток осторожно наслаивают на 4× 5 мл Lymphoprepa (Nycomed) в 15-миллилитровых пробирках центрифуги. Пробирки вращают при 1700 об/мин в течение 30 мин (Sorvall RT6000D) и полученный слой клеток удаляют и переносят в 50 мл пробирки Falcon. Клетки дважды промывают в буфере лизиса для удаления любых оставшихся эритроцитов с последующими двумя промываниями в RPMI/BSA. Клетки ресуспендируют в 5 мл буфера связывания. Количество клеток измеряют на счетчике Coulter и добавляют дополнительный буфер связывания для получения конечной концентрации 1,25× 10⁷ РВМСs/мл.

ii) Анализ

[¹²⁵I]MCP-l получают с использованием конъюгации Bolton и Hunter (Bolton et al., 1973, Biochem. J., 133, 529; Amersham International plc]. Анализы равновесного связывания проводят с использованием способа Ernst et al., 1994, J. Inmnunol., 152, 3541. Вкратце, 50 мкл меченого ¹²⁵I МСР-1 (конечная концентрация 100 мкмоль) добавляют в 40 мкл (5× 10⁵ клеток) клеточной суспензии в 96-луночную планшету. Соединения, разведенные в буфере связывания цельных клеток из исходного раствора 10 мМ в ДМСО, добавляют в конечном объеме 5 мкл для поддержания при анализе постоянной концентрации ДМСО 5%. Общее связывание определяют в отсутствие соединения. Неспецифическое связывание определяют добавлением 5 мкл холодного МСР-1 для получения конечной концентрации при анализе 100 нМ. Конечный объем в ячейках для анализа доводят до 100 мкл буфером связывания цельных клеток и планшеты герметично укупоривают. После инкубации при 37° С в течение 60 мин смеси реакции связывания фильтруют и промывают в течение 10 с с использованием ледяного промывочного буфера с использованием промывателя планшет (Brandel MLR-96T Cell Harvester). Прокладки для фильтров (Brandel GF/B) перед использованием предварительно вымачивают в течение 60 мин в 0,3% полиэтиленимине плюс 0,2% BSA. После фильтрования отдельные фильтры отделяют в пробирки емкостью 3,5 мл (Sarstedt № 55484) и определяют связанный МСР-1, меченый ¹²⁵I (LKB 1277 Gammamaster).

Активность исследуемых соединений определяют с помощью повторяемого дважды анализа с использованием шеститочечных кривых зависимости реакции от дозы и определяют концентрации IC₅₀.

Для испытанных соединений настоящего изобретения при эффективной дозе не наблюдалось никакой физиологически неприемлемой токсичности.

Изобретение далее иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами, в которых при отсутствии других указаний использовались следующие общие процедуры.

i) N,N-диметилформамид (ДМФ) сушат над молекулярными ситами 4А. Безводный тетрагидрофуран (ТГФ) получают из флаконов Aldrich SURESEAL™ . При отсутствии других указаний другие имеющиеся в продаже реагенты используют без дополнительной очистки. Экстракты органического растворителя сушат над безводным МgSO₄.

ii) Если не указано иное, ЯМР ¹Н, ¹³С и ¹⁹F регистрируют на приборах Bruker WM200, WM250, WM300 или WM400 с использованием в зависимости от целесообразности в качестве внутреннего стандарта ДМСЮ-d₆ с Me₄Si или ССl₃F. Химические сдвиги выражают в d (м.д.), а мультиплетности пиков обозначают следующим образом: с, синглет; д, дублет; дд, дублет дублетов; т, триплет; дт, дублет триплетов; кв, квартет; м, мультиплет; шир. с, широкий синглет.

iii) Масс-спектры регистрируют на спектрометрах Kratos MS 9 моделей VG 12-12 квадруполь, VG 70-250 SE, VG ZAB 2-SE или VG-модифицированный AEI.

iv) Для анализа ТСХ используют предварительно покрытые ТСХ пластинки Merck (силикагель 60 F254, d=0,25 мм).

v) Флэш-хроматографию проводят на двуокиси кремния (Merck Kieselgel: Art.9385).

Пример 1

N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Гидроксид натрия (2М, 3 мл) добавляют к перемешиваемому раствору этил-N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоксилата (0,1 г) в ТГФ (3 мл) и метаноле (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток растворяют в воде (5 мл). Раствор подкисляют добавлением водной хлористоводородной кислоты (2М, 4 мл), осаждая продукт в виде твердого вещества белого цвета. Продукт отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (82 мг, 89%).

ЯМР: δ 5,77 (с, 2Н), 6,81 (дд, 1Н), 6,89 (дд, 1Н), 6,95 (д, 1Н), 7,13 (с, 1Н), 7,26 (д, 1Н), 7,34 (д, 1Н), 7,52 (д, 1Н), 9,01 (с, 1Н), 12,85 (с, 1Н); m/z 334 (М-Н⁺).

Процедуру, описанную в представленном выше примере, повторяют с использованием соответствующих этилиндол-2-карбоксилатов. Таким образом получают описанные ниже соединения.

Пример 2

N-[(2,3-дихлорпирид-5-ил)метил]-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 36%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,80 (с, 2Н), 6,84 (дд, 1Н), 6,96 (д, 1Н), 7,14 (с, 1Н), 7,23 (д, 1Н), 7,73 (д, 1Н), 8,06 (д, 1Н); m/z 339 (М-Н⁺) 337, 335.

Пример 3

N-(3-хлор-4-фторбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 68%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,75 (с, 2Н), 6,82 (дд, 1Н), 6,95 (м, 2Н), 7,12 (с, 1Н), 7,2-7,4 (м, 3Н); m/z 320 (М-Н⁺), 318.

Пример 4

N-(4-хлор-3-фторбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 94%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,78 (с, 2Н), 6,78 (дд, 1Н), 6,80 (дд, 1Н), 6,96 (д, 1Н), 7,03 (дд, 1Н), 7,12 (с, 1Н), 7,31 (д, 1Н), 7,43 (т, 1Н); m/z 318 (М-Н⁺).

Пример 5

N-(3-хлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 75%. m/z 300 (М-Н⁺).

Пример 6

N-(3-трифторметилбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 81%. m/z 334 (М-Н⁺).

Пример 7

N-(4-хлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 82%. m/z 300 (М-Н⁺).

Пример 8

3-Бром-N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 95%. m/z 414 (М-Н⁺).

Пример 9

4-Бpoм-N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 96%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,78 (с, 2Н), 6,86 (дд, 1Н), 7,01 (д, 1Н), 7,04 (с, 1Н), 7,33 (с, 1Н), 7,40 (д, 1Н), 7,52 (д, 1Н), 9,78 (с, 1Н), 13,10 (шир. с, 1Н); m/z 414 (М-Н⁺).

Пример 10

N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидрокси-3-метилиндол-2-карбоновая кислота

Выход 73%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 2,44 (с, ЗН), 5,69 (с, 2Н), 6,83 (м, 2Н), 6,92 (д, 1Н), 7,25 (д, 1Н), 7,30 (д, 1Н), 7,50 (д, 1Н), 9,00 (с, 1Н), 12,90 (шир. с, 1Н); m/z 350 (М-Н⁺).

Пример 11

N-(3,4-дихлорбензил)-4-фтор-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 68%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,80 (с, 2Н), 6,88 (м, 1Н), 7,00 (т, 1Н), 7,20 (м, 2Н), 7,32 (м, 1Н), 9,25 (с, 1Н), 13,10 (с, 1Н); m/z (М-Н⁺) 351,9.

Пример 12

N-(3,4-дихлорбензил)-3-метокси-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 73%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 4,3 (с, 3Н), 5,7 (с, 2Н), 6,9 (м, 2Н), 7,1-7,4 (м, 4Н); m/z 364, 366 (М-Н⁺).

Пример 13

N-(3,4-дихлорбензил)-3-хлор-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 97%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,75 (с, 2Н), 6,9 (м, 3Н), 7,3 (с, 1Н), 7,45 (д, 1Н), 7,5 (д, 1Н), 9,35 (с, 1Н); m/z 368 (М-Н⁺).

Пример 14

N-(3,4-дихлорбензил)-4-хлор-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Выход 83%. ЯМР (СD₃SОСD₃) δ 5,79 (с, 2Н), 6,88 (дд, 1Н), 7,01 (д, 1Н), 7,11 (с, 1Н), 7,3 (д, 1Н), 7,38 (д, 1Н), 7,51 (д, 1Н), 9,67 (шир. с, 1Н); m/z 368,2 (М-Н⁺).

Получение исходных материалов

Исходные материалы для приведенных выше примеров представляют или имеющиеся в продаже материалы, или легко получаются стандартными способами из известных материалов. Например, следующие реакции (Способы A-J) являются иллюстрациями, а не ограничениями получения исходных материалов, используемых в указанных выше реакциях.

Способ А

3-Хлор-4-фторбензилбромид

Раствор 3-Хлор-4-фторбензальдегида (3 г) в ТГФ (40 мл) добавляют в течение 2 мин к перемешиваемой суспензии боргидрида натрия (1,07 г) в метаноле (40 мл) при 0° С. Смеси дают возможность подогреться до комнатной температуры и затем реакцию гасят водой. Полученную суспензию разделяют между водой и простым диэтиловым эфиром и объединенные органические экстракты сушат и концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в дихлорметане (90 мл) и добавляют трифенилфосфин (4,62 г) и тетрабромметан (6,64 г) при 0° С. Смеси дают возможность подогреться до комнатной температуры в течение ночи, затем концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента изо-гексана с получением желаемого продукта (3,57 г, 85%). ЯМР: δ 4,7 (с, 2Н), 7,4 (м, 2Н), 7,7 (м, 1Н).

Аналогичным образом, но исходя из 3-фтор-4-хлорбензальдегида, получают:

3-Фтор-4-хлорбензилбромид

Выход 74%. ЯМР: δ 4,5 (с, 2Н), 7,1 (т, 1Н), 7,25 (м, 1Н), 7,45 (дд, 1Н).

Способ В

2,3-Дихлор-5-(гидроксиметил)пиридин

Комплекс борана-тетрагидрофурана (1М раствор в тетрагидрофуране, 52 мл) добавляют к перемешиваемому раствору 5,6-дихлорникотиновой кислоты (2 г) в тетрагидрофуране (60 мл) в течение 20 мин при 0° С. Реакционной смеси дают возможность подогреться до комнатной температуры в течение 90 мин и затем охлаждают до 0° С и реакцию гасят водой (100 мл). Раствор насыщают хлоридом натрия в виде твердого вещества и экстрагируют этилацетатом и объединенные органические экстракты сушат и концентрируют в вакууме. Остаток растирают в порошок с дихлорметаном-50% этилацетатом и твердый побочный продукт удаляют фильтрованием. Фильтрат концентрируют в вакууме и очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента изогексан/этилацетат (1:1 об./об.) с получением продукта в виде белого твердого вещества (820 мг, 45%). ЯМР: δ 4,55 (д, 2Н), 5,5 (т, 1Н), 8,0 (м, 1Н), 8,3 (м, 1Н); m/z 178,1 (М+Н⁺).

Способ С

2,3-Дихлор-5-(бромметил)пиридин

2,3-Дихлор-5-(гидроксиметил)пиридин (275 мг) растворяют в дихлорметане (10 мл) и перемешивают в присутствии трифенилфосфина (444 мг) и тетрабромметана (641 мг) в течение ночи. Раствор концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента изогексана: 2,5% этилацетата с получением продукта в виде твердого белого вещества (270 мг, 73%). ЯМР: δ 4,75 (с, 2Н), 8,25 (м, 1Н), 8,5 (м, 1Н); m/z 242 (М+Н⁺).

Способ D

Этил-5-ацетокси-М-(3,4-дихлорбензил)индол-2-карбоксилат

i) Этил-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

Трибромид бора (64,58 г) по каплям добавляют к перемешиваемому раствору этил-5-метоксииндол-2-карбоксилата (20 г) в дихлорметане (1000 мл) при -78° С в атмосфере аргона. Реакционной смеси дают возможность подогреться до комнатной температуры и перемешивают еще в течение 2 ч. Реакционную смесь выливают в раствор смеси льда/насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия при перемешивании и экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические экстракты промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, водой, водным насыщенным раствором хлорида натрия и сушат. Раствор концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента смеси 0-60% простого диэтилового эфира: изо-гексана с получением продукта в виде белого твердого вещества (9,02 г, 48%). ЯМР: δ 1,31 (т, 3Н), 4,29 (кв, 3Н), 6,79 (дд, 1Н), 6,90 (дд, 1Н), 7,22 (д, 1Н), 8,84 (с, 1Н), 11,52 (шир.с, 1Н); m/z 206 (М+Н⁺).

ii) Этил-5-ацетоксииндол-2-карбоксилат

Перемешиваемый раствор этил-5-гидроксииндол-2-карбоксилата (7,79 г) и 4-диметиламинопиридина (20 мг) в уксусном ангидриде (80 мл) нагревают при 80° С в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток растворяют в ацетилацетате. Объединенные органические экстракты промывают хлористоводородной кислотой (2М), насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, водой, водным насыщенным раствором хлорида натрия и сушат. Раствор концентрируют в вакууме с получением продукта в виде твердого вещества желтого цвета (9,39 г, 100%). ЯМР: δ 1,20 (т, 3Н), 2,10 (с, 3Н), 4,19 (кв, 2Н), 6,86 (дд, 1Н), 6,97 (д, 1Н), 7,20 (с, 1Н), 7,29 (д, 1Н); m/z 248 (М+Н⁺).

iii) Этил-5-ацетокси-N-(3,4-дихлорбензил)индол-2-карбоксилат

3,4-дихлорбензилбромид (5,96 г) добавляют к перемешиваемому раствору этил-5-ацетоксииндол-2-карбоксилата (5,4 г) и карбоната калия (6,94 г) в ацетонитриле (500 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь нагревают при 80° С в течение 16 ч, затем концентрируют в вакууме и остаток распределяют между этилацетатом и водой. Объединенные органические экстракты промывают водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат. Растворитель удаляют в вакууме и остаток растирают в порошок с изогексаном с получением продукта в виде кремового твердого вещества (5,55 г, 63%). ЯМР: δ 1,27 (т, 3Н), 2,27 (с, 3Н), 4,28 (кв, 2Н), 5,82 (с, 2Н), 6,90 (д, 1Н), 7,09 (дд, 1Н), 7,33-7,40 (м, 2Н), 7,46 (д, 1Н), 7,52 (д, 1Н), 7,60 (д, 1Н).

Процедуры, описанные в способе D i)-iii), повторяют с использованием соответствующего бензилгалогенида или с использованием алкилиндол-2-карбоксилатов в соответствии со способом получения F&G, с соответствующим бензилгалогенидом. Таким образом получают описанные ниже соединения.

Способ D1

Этил-5-ацетокси-N-[(2,3-дихлорпирид-5-ил)метил]индол-2-карбоксилат

Выход 90%. ЯМР: δ 1,27 (т, 3Н), 2,26 (с, 3Н), 4,28 (кв, 2Н), 5,85 (с, 2Н), 7,12 (дд, 1Н), 7,38 (с, 1Н), 7,47 (д, 1Н), 7,68 (д, 1Н), 7,78 (д, 1Н), 8,10 (д, 1Н); m/z 409 (М+Н⁺), 407.

Способ D2

Этил-5-ацетокси-N-(3-хлор-4-фторбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 57%. ЯМР (СDСl₃): δ 1,37 (т, 3Н), 2,33 (с, 3Н), 4,35 (кв, 2Н), 5,74 (с, 2Н), 6,90 (м, 1Н), 7,00 (д, 1Н), 7,05 (дд, 1Н), 7,13 (дд, 1Н), 7,26 (с, 1Н), 7,36 (с, 1Н), 7,22 (д, 1Н).

Этил-5-ацетокси-N-(4-хлор-3-фторбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 73%. m/z 390 (МН⁺).

Этил-5-ацетокси-N-(3-хлорбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 93%. m/z 372 (МН⁺).

Этил-5-ацетокси-N-(3-трифторметилбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 91%. m/z 406 (МН⁺).

Этил-5-ацетокси-N-(4-хлорбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 70%. m/z 372 (МН⁺).

Этил-3-ацетокси-3-бром-N-(3,4-дихлорбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 86%. m/z 486 (МН⁺).

Этил-5-ацетокси-4-бром-N-(3,4-дихлорбензил)индол-2-карбоксилат

Выход 62%. ЯМР: δ 1,40 (т, 3Н), 2,39 (с, 3Н), 4,38 (кв, 2Н), 5,77 (с, 2Н), 6,82 (дд, 1Н), 7,08 (д, 1Н), 7,18 (с, 1Н), 7,22 (д, 1Н), 7,32 (д, 1Н), 7,42 (с, 1Н); m/z 486 (МН⁺).

Этил-5-ацетокси-N-(3,4-дихлорбензил)-3-метилиндол-2-карбоксилат

Выход 79%. ЯМР: δ 1,40 (т, 3Н), 2,36 (с, 3Н), 2,40 (с, 3Н), 4,35 (кв, 2Н), 5,76 (с, 2Н), 6,83 (дд, 1Н), 7,00 (д, 1Н), 7,10 (д, 1Н), 7,19 (с, 1Н), 7,30 (д, 1Н), 7,40 (с, 1Н); m/z 421 (МН⁺).

Этил-5-ацетокси-N-(3,4-дихлорбензил)-3-хлориндол-2-карбоксилат

Выход 83%. ЯМР: δ 1,25 (т, 3Н), 2,25 (с, 3Н), 4,3 (кв, 2Н), 5,8 (с, 2Н), 6,9 (д, 1Н), 7,2 (м, 1Н), 7,4 (м, 2Н), 7,5 (д, 1Н), 7,7 (д, 1Н); m/z 441,8 (М+Н⁺).

Способ Е

Этил-N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

Этоксид натрия (1,86 г) добавляют к перемешиваемому раствору этил-5-ацетокси-N-(3,4-дихлорбензил)индол-2-карбоксилата (5,55 г) в этаноле (50 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, затем концентрируют в вакууме и остаток подкисляют водной хлористоводородной кислотой (2М) и экстрагируют дихлорметаном. Объединенные органические экстракты промывают водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат. Растворитель удаляют в вакууме и остаток растирают в порошок с гексаном/диэтиловым эфиром с получением продукта в виде белого твердого вещества (3,17 г, 92%). ЯМР: δ 1,26 (т, 3Н), 4,25 (кв, 2Н), 5,75 (с, 2Н), 6,81-6,91 (м, 2Н), 6,98 (д, 1Н), 7,19 (с, 1Н), 7,29 (д, 1Н), 7,38 (д, 1Н), 7,50 (д, 1Н), 9,06 (с, 1Н); m/z 364 (М+Н⁺).

Способ F

Этил-5-ацетокси-3-броминдол-2-карбоксилат

N-бромсукцинимид (0,14 г) добавляют к перемешиваемому раствору этил-5-ацетоксииндол-2-карбоксилата (0,2 г) в ДМФ (3,0 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч, затем выливают в воду. Полученный осадок фильтруют и сушат в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде белого порошка (0,23 г, 87%). ЯМР: δ 1,38 (т, 3Н), 2,23 (с, 3Н), 4,38 (кв 2Н), 7,10 (дд, 1Н), 7,23 (д, 1Н), 7,50 (д, 1Н), 12,28 (шир.с, 1Н); m/z 326 (М⁺).

Способ F1

Этил-5-ацетокси-3-хлориндол-2-карбоксилат

Раствор этил-5-ацетоксииндол-2-карбоксилата (500 мг) в дихлорметане (10 мл) перемешивают при комнатной температуре в присутствии N-хлорсукцинимида (297 мг) и карбоната калия (279 мг) в течение ночи. Полученный осадок собирают фильтрованием, промывают холодным дихлорметаном с последующим промыванием водой и сушат в вакууме в течение ночи с получением желаемого продукта в виде белого порошка (425 мг, 75%). ЯМР: δ 1,35 (т, 3Н), 2,25 (с, 3Н), 4,4 (кв, 2Н), 7,1 (д, 1Н), 7,3 (с, 1Н), 7,5 (д, 1Н), 12,2 (с, 1Н); m/z 281,9 (М+Н⁺).

Способ G

Этил-5-ацетокси-3-метилиндол-2-карбоксилат

i) Этил-5-метокси-3-метилиндол-2-карбоксилат

Концентрированную серную кислоту (1 мл) добавляют к раствору гидрохлорида 4-метоксифенилгидразина (11,2 г) и 2-оксимасляной кислоты (8,72 г) в этаноле (250 мл), и раствор нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждают, концентрируют в вакууме и остаток растирают с этанолом с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (8,8 г, 59%). ЯМР: δ 1,36 (т, 3Н), 3,76 (с, 3Н), 4,30 (кв, 2Н), 6,88 (дд, 1Н), 7,03 (д, 1Н), 7,28 (д, 1Н), 11,28 (шир.с, 1Н); m/z 232 (М-Н⁺).

ii) Этил-5-ацетокси-3-метилиндол-2-карбоксилат

Трибромид бора (25 г) добавляют по каплям к перемешиваемому раствору этил-5-метокси-3-метилиндол-2-карбоксилата (2,0 г) в сухом дихлорметане (250 мл) при -78° С в атмосфере аргона. Реакционной смеси дают подогреться до комнатной температуры и перемешивают еще в течение 2 ч. Реакционную смесь выливают в раствор льда/насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия при перемешивании и экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические экстракты промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат (MgSO₄). Раствор концентрируют в вакууме и остаток растворяют в этилацетате. Добавляют DMAP (диметиламинопиридин, 20 мг) и уксусный ангидрид (0,5 мл) и раствор нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 5 мин. Реакционную смесь охлаждают, концентрируют в вакууме и остаток растирают с простым эфиром с получением указанного в заголовке соединения в виде белого порошка (0,4 г, 18%). ЯМР: δ 1,37 (т, 3Н), 2,25 (с, 3Н), 2,50 (с, 3Н), 4,34 (кв, 2Н), 7,00 (дд, 1Н), 7,37 (д, 1Н), 7,40 (д, 1Н), 11,52 (шир.с, 1Н); m/z 260 (М-Н⁺).

Аналогичным образом, но исходя из этил-4-бром-5-метоксииндол-2-карбоксилата получают:

Этил-5-ацетокси-4-броминдол-2-карбоксилат ЯМР: δ 1,42 (т, 3Н), 2,39 (с, 3Н), 4,42 (кв, 2Н), 7,02 (д, 1Н), 7,23 (с, 1Н), 7,35 (д, 1Н), 9,22 (шир.с, 1Н); m/z 324, 326 (М-Н⁺).

Способ Н

Метил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-фтор-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

(i) 2-фтор-3-бензилоксибензальдегид

2-фтор-3-гидроксибензальдегид (16,49 г) растворяют в диметилформамиде (200 мл) и перемешивают в атмосфере аргона. Добавляют гидрид натрия (60% в минеральном масле, 5,18 г) и смесь перемешивают в течение 30 мин. Добавляют бензилбромид (16,8 мл) и смесь перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и полученный остаток распределяют между диэтиловым простым эфиром (200 мл) и водой (200 мл). Объединенные органические экстракты промывают водой (400 мл), сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной флэш-хроматографией с использованием градиента 0-10% этилацетата/изогексана в качестве элюента с получением продукта в виде желтого твердого вещества (18,41 г). ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 5,20 (с, 2Н), 7,2-7,6 (м, 8Н), 10,21 (с, 1Н).

(ii) Метил-2-азидо-3-(2-фтор-3-бензилоксифенил)пропеноат

Смесь метилазидоацетата (36,64 г) и 2-фтор-3-бензилоксибензальдегида (18,32 г) в метаноле (250 мл) добавляют по каплям при перемешивании в течение 1 ч к смеси метоксида натрия (17,20 г) в метаноле (100 мл) при -25° С в токе аргона. Смесь оставляют для перемешивания в течение 20 мин, дают подогреться до 5° С и перемешивают в течение ночи.

Полученный осадок отфильтровывают, затем промывают последовательно холодным метанолом, разбавленным раствором уксусной кислоты в воде и водой. Полученное твердое вещество сушат в вакууме с получением продукта в виде бледно-коричневого твердого вещества (16,70 г), которое используют без очистки.

(iii) Метил-4-фтор-5-бензилоксииндол-2-карбоксилат

Раствор метил-2-азидо-3-(2-фтор-3-бензилоксифенил)пропеноата (16,7 г) в ксилоле (600 мл) добавляют по каплям при перемешивании к кипящему с обратным холодильником ксилолом (2,4 л) в течение 1 ч, а затем перемешивают еще в течение 20 мин. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и очищают колоночной флэш-хроматографией с использованием градиента 0-100% этилацетата/изогексана в качестве элюента с получением продукта в виде желтого твердого вещества (12,93 г). ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 3,85 (с, 3Н), 5,15 (с, 2Н), 7,05-7,45 (м, 8Н), 12,06 (с, 1Н); m/z (+) 300,4 (МН⁺).

(iv) Метил-N-(3, 4-дихлорбензил) -4-фтор-5-бензилоксииндол-2-карбоксилат

Гидрид натрия (60% в минеральном масле, 589 мг) добавляют к раствору метил-4-фтор-5-бензилоксииндол-2-карбоксилата (4 г) в диметилформамиде (100 мл) и смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 30 мин. Добавляют 3,4-дихлорбензилхлорид (2,22 мл) и смесь перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и остаток распределяют между диэтиловым эфиром (100 мл) и водой (100 мл). Органические экстракты промывают водой (100 мл), сушат (MgSO₄), концентрируют в вакууме и очищают колоночной флэш-хроматографией с использованием изогексана с последующим промыванием 5% этилацетата/изогексана в качестве элюента с получением продукта в виде желтого кристаллического твердого вещества (4,61 г). ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 3,80 (с, 3Н), 5,15 (с, 2Н), 5,80 (с, 2Н), 6,85 (м, 1Н), 7,25-7,52 (м, 10Н); m/z (+) 458,2 (МН⁺).

(v) Метил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-фтор-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

Смесь метил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-фтор-5-бензилоксииндол-2-карбоксилата (8,22 г) и 5% Pd/C (200 мг) в этилацетате (250 мл) перемешивают в атмосфере водорода в течение ночи, фильтруют через целит. Концентрируют в вакууме и очищают колоночной флэш-хроматографией с использованием градиента 0-50% этилацетата/изогексана в качестве элюента с получением продукта в виде коричневого твердого вещества (6,18 г). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆) δ 3,80 (с, 3Н), 5,75 (с, 2Н), 6,85 (м, 1Н), 7,00 (т, 1Н), 7,22 (м, 2Н), 7,30 (м, 1Н), 7,50 (м, 1Н); m/z (-) 366,2 (МН^-).

Способ I

Этил-N-(3,4-дихлорбензил)-3-метокси-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

(i) Этил-5-бензилоксидиазоиндол-2-карбоксилат

Нитрит натрия (6 г) порциями добавляют к раствору этил-5-бензилоксииндол-2-карбоксилата в этилацетате (40 мл) и уксусной кислоте (20 мл). Смесь перемешивают в течение 18 ч и затем распределяют между этилацетатом и водой. Органические экстракты промывают водой, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и сушат. Растворитель удаляют в вакууме и полученную смолу растирают с диэтиловым простым эфиром с получением продукта в виде оранжевого порошка (1,8 г). ЯМР: δ 1,45 (т, 3Н), 4,5 (кв, 2Н), 5,1 (с, 2Н), 7,05 (м, 2Н), 7,3 (м, 5Н), 7,9 (д, 1Н); m/z 322 (М+Н⁺).

(ii) Этил-3-метокси-5-бензилоксииндол-2-карбоксилат

Родийоктаноат (300 мг) добавляют к перемешиваемому раствору этил-5-бензилоксидиазоиндол-2-карбоксилата (2,0 г) в толуоле (100 мл) и метаноле (10 мл). Смесь кипятят с обратным холодильником в инертной атмосфере в течение 2,5 ч. Раствор концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием 30-50% диэтилового простого эфира/изогексана с получением оранжевого твердого вещества (1,41 г). ЯМР: δ 1,4 (т, 3Н), 4,05 (с, 3Н), 4,4 (кв, 2Н), 5,1 (с, 2Н), 7,1 (дд, 1Н), 7,2-7,5 (м, 8Н)); m/z 326 (МН⁺).

(iii) Этил-N-(3, 4-дихлорбензил) -3-метокси-5-бензилоксииндол-2-карбоксилат

3,4-Дихлорбензилхлорид (0,72 мл) добавляют к перемешиваемому раствору этил-3-метокси-5-бензилоксииндол-2-карбоксилата (1,40 г), карбоната калия (0,90 г) и йодида калия (0,1 г) в ДМФ (50 мл) в инертной атмосфере. Реакционную смесь нагревают до 50° С в течение 6 ч, затем распределяют между этилацетатом и водой. Объединенные органические экстракты промывают водой, затем 3 раза насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат. Растворитель удаляют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием 10-30% этилацетата/изогексана с получением желтого масла (0,9 г). ЯМР: δ 1,4 (т, 3Н), 4,0 (с, 3Н), 4,4 (кв, 2Н), 5,1 (с, 2Н), 5,6 (с, 2Н), 6,9 (дд, 1Н), 7,0-7,5 (м, 9Н); m/z 484 (МН⁺).

(iv) Этил-N-(3,4-дихлорбензил)-3-метокси-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

5% Pd/C (100 мг) добавляют к перемешиваемому раствору этил-N-(3,4-дихлорбензил-3-метокси-5-бензилоксииндол-2-карбоксилата (0,9 г) в этилацетате (50 мл) и смесь гидрируют в течение 12 ч. Катализатор отфильтровывают и фильтрат выпаривают с получением коричневого масла (0,61 г), которое используют без дальнейшей очистки. ЯМР: δ 1,4 (т, 3Н), 4,0 (с, 3Н), 4,4 (кв, 2Н), 5,6 (с 2Н), 6,8 (дд, 1Н), 6,9 (дд, 1Н), 7,1 (м, 3Н), 7,3 (д, 1Н)); m/z 394 (МН⁺).

Способ J

Этил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-хлор-5-метоксииндол-2-карбоксилат

i) Этил-2-азидо-3-(2-хлор-3-метоксифенил)пропеноат

Раствор этилазидоацетата (9,9 г) и 2-хлор-3-метоксибензальдегида (3 г) в этаноле (20 мл) добавляют по каплям в раствор этоксида натрия (4,7 г) в этаноле (10 мл) при 0° С. Реакционной смеси дают подогреться до температуры окружающей среды в течение 18 ч, затем распределяют между 2 н. НСl (50 мл) и дихлорметаном (250 мл). Органическую фазу сушат (МgSO₄), концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием изогексана-12% этилацетата/ изогексана в качестве элюента с получением продукта в виде бледно-желтого кристаллического твердого вещества (2,2 г, 44%). Оно используется без дальнейшей очистки.

ii) Этил-4-хлор-5-метоксииндол-2-карбоксилат

Раствор этил-2-азидо-3-(2-хлор-3-метоксифенил)пропеноата (2,22 г) в ксилоле (100 мл) нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 30 мин, концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием изогексана-50% этилацетат в качестве элюента с получением продукта в виде бледно-желтого твердого вещества (1,34 г, 67%). ЯМР: δ (СDСl₃) 1,31 (т, 3Н), 3,84 (с, 3Н), 4,32 (кв, 2Н), 7,0 (д, 1Н), 7,22 (д, 1Н), 7,39 (д, 1Н), 12,2 (ушир.с, 1Н).

(iii) Этил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-хлор-5-метоксииндол-2-карбоксилат

Гидрид натрия (60 мг) добавляют к раствору этил-4-хлор-5-метоксииндол-2-карбоксилата (250 мг), 3,4-дихлорбензилхлорида (0,21 мл) и тетрабутиламмонийиодида (3 мг) в ДМФ при температуре окружающей среды в инертной атмосфере. Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 18 ч, затем распределяют между этилацетатом (30 мл) и водой (30 мл). Органическую фазу сушат (МgSО₄), концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием изогексана-15% этилацетата в качестве элюента с получением продукта в виде белого твердого вещества (196 мг, 48%). ЯМР: δ (СDСl₃) 1,39 (т, 3Н), 3,93 (с, 3Н), 4,32 (кв, 2Н), 5,73 (с, 2Н), 6,84 (дд, 1Н), 7,06-7,16 (м, 3Н), 7,31 (д, 1Н), 7,42 (с, 1Н).

iv) Этил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-хлор-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

Триметилсилилиодид (0,6 мл) добавляют к раствору этил-N-(3,4-дихлорбензил)-4-хлор-5-метоксииндол-2-карбоксилата (190 мг) в хлороформе (20 мл). Смесь нагревают до 50° С в течение 18 ч, затем выливают в метанол (50 мл) и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией с использованием смеси изогексан-20% этилацетат/изогексан в качестве элюента с получением продукта в виде желтого твердого вещества (100 мг, 71%). ЯМР: δ (СDСl₃) 1,39 (т, 3Н), 4,35 (кв, 2Н), 5,72 (с, 2Н), 6,84 (дд, 1Н), 7,05-7,13 (м, 3Н), 7,3 (д, 1Н), 7,35 (с, 1Н); m/z 396, 2/398,2 (М-Н⁺).

Пример 15

N-(3,4-Дихлорбензил)-2-трифторметилсульфонамидо-5-гидроксииндол

Метоксид натрия (21 мг) добавляют к перемешиваемому раствору N-(3,4-дихлорбензил)-2-трифторметилсульфонамидо-5-ацетоксииндола (90 мг) в метаноле (10 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 1,5 ч, затем концентрируют и подкисляют добавлением водного раствора хлористоводородной кислоты (2М, 5 мл), экстрагируют дихлорметаном и концентрируют в вакууме с получением коричневого масла (50 мг). ЯМР: δ 5,8 (с, 2Н), 6,7 (дд, 1Н), 6,9 (м, 1Н), 7,0 (дд, 1Н), 7,2 (дд, 1Н), 7,3 (м, 1Н), 7,5 (д, 1Н); m/z 465, 467 (М-Н⁺).

Исходный материал получают следующим образом:

(i) N-(3, 4-Дихлорбензил)-5-ацетоксииндол-2-карбоновая кислота

Диметиламинопиридин (100 мг) и уксусный ангидрид (1,12 мл) добавляют к раствору N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновой кислоты в этилацетате (50 мл) и перемешивают при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Добавляют этанол (10 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель частично выпаривают и добавляют изогексан с получением осадка, который отфильтровывают и сушат с получением белого твердого вещества (1,12 г). ЯМР: δ 2,25 (с, 3Н), 5,85 (с, 2Н), 6,9 (дд, 1Н), 7,3-7,6 (м, 5Н); m/z 376, 378 (М-Н⁺).

(ii) N-(3,4-Дихлорбензил)-2-трифторметилсульфонамидо-5-ацетоксииндол

К перемешиваемому раствору N-(3,4-дихлорбензил)-5-ацетоксииндол-2-карбоновой кислоты в ДМФ (5 мл) в инертной атмосфере добавляют HATU (0,27 г), DIPEA (0,12 мл) и трифторметилсульфонамид (97 мг). Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 18 ч. Смесь выливают в насыщенный раствор бикарбоната натрия и полученный осадок отфильтровывают и сушат с получением продукта (90 мг). ЯМР: δ 2,25 (с, 3Н), 5,9 (с, 2Н), 6,9 (дд, 1Н), 7,0 (дд, 1Н), 7,1 (с, 1Н), 7,35 (м, 1Н); m/z 506, 508 (М-Н⁺).

Пример 16

N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-тетразол

Хлорид аммония (54 мг) и азид натрия (65 мг) добавляют к перемешиваемому раствору N-(3,4-дихлорбензил)-5-ацетоксииндол-2-нитрила в ДМФ (5 мл). Реакционную смесь нагревают до 100° С в течение 10 ч. Добавляют дополнительное количество хлорида аммония (35 мг) и азида натрия (42 мг) и реакционную смесь нагревают до 100° С в течение 18 ч. Реакционную смесь подкисляют водным раствором хлористоводородной кислоты (2М, 10 мл) и экстрагируют этилацетатом, сушат, концентрируют в вакууме и очищают колоночной хроматографией с использованием 20% этилацетата в изогексане, увеличивая до 5% метанола в этилацетате, с получением продукта в виде коричневого масла (40 мг), который затвердевает при стоянии. ЯМР: δ 5,9 (с, 2Н), 6,75 (дд, 1Н), 6,9 (дд, 1Н), 7,1 (с, 1Н), 7,1-7,3 (м, 2Н), 7,5 (д, 1Н), 9,0 (с, 1Н); m/z 360, 362 (МН⁺).

Исходный материал получают следующим образом:

Метансульфонилхлорид (0,5 мл) добавляют к охлажденному (0° С) раствору N-(3,4-дихлорбензил)-5-ацетоксииндол-2-карбоновой кислоты (1,12 г) в пиридине (30 мл) и перемешивают при 0° С в течение 1,5 ч. Газообразный аммиак барботируют через реакционную смесь в течение 15 мин, затем избыток аммиака удаляют в вакууме. Реакционную смесь охлаждают до 0° С и к перемешиваемому раствору добавляют метилсульфонилхлорид (2,5 мл) и дают возможность за 18 ч достичь температуры окружающей среды. Добавляют метансульфонилхлорид (2 мл) и реакционную смесь оставляют стоять в течение 60 ч. Растворитель удаляют в вакууме, повторно растворяют в дихлорметане и промывают 3 раза смесью водного раствора хлористоводородной кислоты (1М) и насыщенного раствора хлорида аммония (1:1). Органические экстракты сушат, концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием 10-25% этилацетат/изо-гексана с получением желаемого продукта (300 мг). ЯМР: δ 2,25 (с, 3Н), 5,6 (с, 2Н), 7,0 (дд, 1Н), 7,45-7,65 (м, 4Н), 7,7 (д, 1Н).

Пример 17

N-(3,4-дихлорфенилсульфонил)-5-гидроксииндол-2-карбоновая кислота

Раствор безводного иодида лития (870 мг) и метил-N-(3,4-дихлорфенилсульфонил)-5-гидроксииндол-2-карбоксилата (260 мг) в пиридине (15 мл) перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в воде (20 мл) и подкисляют уксусной кислотой. Продукт экстрагируют этилацетатом и объединенные экстракты сушат, концентрируют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента 1% уксусной кислоты, содержащей дихлорметан-50% этилацетат с получением желаемого продукта в виде стекла (72 мг, 29%). ЯМР: δ 6,9 (м, 2Н), 7,25 (с, 1Н), 7,85 (д, 1Н), 7,9 (м, 2Н), 8,15 (с, 1Н), 9,5 (с, 1Н); m/z 385,8 (М-Н⁺).

Исходный материал получают следующим образом:

(i) Метил N-(3,4-дихлорфенилсульфонил)-5-бензилоксииндол-2-карбоксилат

Гидрид натрия (60% дисперсия, 444 мг) добавляют к перемешиваемому раствору метил-5-бензилоксииндол-2-карбоксилата (2,08 г) в ДМФ (50 мл) при комнатной температуре. Через 1 ч добавляют 3,4-дихлорбензолсульфонилхлорид (2,72 г). Перемешивание продолжают в течение 2 ч, после чего реакционную смесь распределяют между водой и этилацетатом. Объединенные органические экстракты сушат и концентрируют в вакууме, и остаток очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента смеси изогексан-20% этилацетат с получением желаемого продукта в виде белого твердого вещества (2,02 г, 56%). ЯМР: δ 3,85 (с, 3Н), 5,1 (с, 2Н), 7,2 (м, 1Н), 7,4 (м, 7Н), 7,9 (с, 2Н), 8,0 (д, 1Н), 8,2 (с, 1Н); m/z 489,8 (МН⁺).

(ii) Метил N-(3, 4-дихлорфенилсульфонил)-5-гидроксииндол-2-карбоксилат

Суспензию 5% палладия на угле в этилацетате (450 мл) и метил-N-(3,4-дихлорфенилсульфонил)-5-бензилоксииндол-2-карбоксилат (2,01 г) перемешивают при 60° С в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение 48 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента 20% этилацетат/изогексан с получением желаемого продукта в виде смолы (270 мг, 16%). ЯМР: δ 3,85 (с, 3Н), 7,0 (м, 2Н), 7,35 (с, 1Н), 7,9 (м, 3Н), 8,1 (с, 1Н), 9,6 (с, 1Н); m/z 401,9 (МН⁺).

Пример 18

N-(3,4-дихлорбензил)-5-ацетоксииндол-2-карбоновая кислота

К раствору N-(3,4-дихлорбензил)-5-гидроксииндол-2-карбоновой кислоты (10 г) в теплом этилацетате (250 мл) добавляют 4-диметиламинопиридин (100 мг) и уксусный ангидрид (5,0 мл) и полученную смесь перемешивают в течение 2 ч. Органические экстракты промывают 1 н. HCl и сушат. Добавляют гексан, чтобы вызвать кристаллизацию продукта. Твердое вещество отфильтровывают и промывают гексаном с получением желаемого продукта (5 г, 44%).¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 2,25 (с, 3Н), 5,85 (с, 2Н), 6,9 (дд, 1Н), 7,05 (дд, 1Н), 7,3-7,6 (м, 5Н); m/z 378, 380 (МН⁺).

Пример 19

Фармацевтические композиции

Данный пример иллюстрирует, но без ограничения ими, соответствующие определенные в данной заявке фармацевтические дозированные лекарственные формы изобретения (причем активный ингредиент именуется “Соединением X”) для лечебного или профилактического применения на людях:

Пример А

Соединение Х в указанных выше композициях может включать соединение, указанное в примерах 1-3.

Указанные выше композиции могут быть получены с помощью обычных процедур, хорошо известных в фармацевтической области. Таблетки (а)-(с) могут быть покрыты растворимой в кишечнике оболочкой с помощью обычных средств, например, с обеспечением покрытия ацетатфталатом целлюлозы. Аэрозольные композиции (h)-(k) могут применяться в сочетании со стандартными аэрозольными дозаторами, суспендирующие агенты сорбитантриолеат и соевый лецитин могут быть заменены альтернативными суспендирующими агентами, такими как сорбитанмоноолеат, сорбитансесквиолеат, полисорбат 80, полиглицеринолеат или олеиновая кислота.

Результаты даны в таблице.

Изобретение относится к производным индола общей формулы I:

где R¹ представляет водород, галоген, метокси; R² представляет водород, галоген, метил, этил, метокси; R³ представляет карбокси, тетразолил или –CONHSO₂R⁴, в котором R⁴ представляет метил, этил, фенил, 2,5-диметилизоксазолил, трифторметил; Т представляет –СН₂- или –SO₂-; и кольцо А представляет 3-хлорфенил, 4-хлорфенил, 3-трифторметилфенил, 3,4-дихлорфенил, 3,4-дифторфенил, 3-фтор-4-хлорфенил, 3-хлор-4-фторфенил, 2,3-дихлорпирид-5-ил; или их фармацевтически приемлемые соли или сложные эфиры, а также фармацевтические композиции, содержащие их. Данные соединения и композиции могут применяться при лечении заболевания, опосредованного моноцитарным хемоаттрактантным белком-1 или RANTES (регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками), такого как воспалительное заболевание. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Производные индола формулы (I)

в которой R¹ представляет водород, галоген или метокси;

R² представляет водород, галоген, метил, этил или метокси;

R³ представляет карбокси, тетразолил или –CONHSO₂R⁴, где R⁴ представляет метил, этил, фенил, 2,5-диметилизоксазолил или трифторметил;

Т представляет -СН₂- или -SO₂;

кольцо А представляет 3-хлорфенил, 4-хлорфенил, 3-трифторметилфенил, 3,4-дихлорфенил, 3,4-дифторфенил, 3-фтор-4-хлорфенил, 3-хлор-4-фторфенил или 2,3-дихлорпирид-5-ил,

или его фармацевтически приемлемая соль или сложный эфир.

7. Соединение по п.1, в котором в соединении формулы (I) R¹ представляет водород, R² представляет водород, R³ представляет карбоксигруппу, Т представляет -СН₂-, и кольцо А представляет 3,4-дихлорфенил или 3-хлор-4-фторфенил, или его фармацевтически приемлемая соль или сложный эфир.

в которой R^а представляет^{карбокси, или ее защищенную форму;}

R^b представляет водород или подходящую гидроксизащитную группу;

R¹ и R² представляют группы, определенные в п.1, с соединением формулы (III)

в которой Т и кольцо А имеют значения, определенные в п.1;

L представляет удаляемую группу,

и после этого при необходимости осуществляют удалениe любой защитной группы, или переводят в фармацевтически приемлемую соль или в сложный эфир.