СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТАНДРОСТЕНОЛОНА Российский патент 2004 года по МПК C12P33/02 C12P33/02 C12R1/06 C12P33/02 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения высокоактивного орального анаболического стероида - метандростенолона (17β-гидрокси-17-метиландроста-1,4-диен-3-он).

Как правило, 17β-гидрокси-17-метиландроста-1,4-диен-3-он (МЕТА) получают 1,2-дегидрированием 17α-метилтестостерона (МТС). В литературных источниках описаны как химические, так и микробиологические способы получения МЕТА из МТС [Phan Gnoc Kink et al., Rev. Pharm. 1993. р.66; Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М.: Наука. 1970; Войшвилло Н.Е., Турута А.М., Камерницкий А.В. Известия РАН, сер.хим., 1994. №4. стр.567].

Известные способы химического дегидрирования предполагают использование селенсодержащих соединений [Phan Gnoc Kink et al., Rev. Pharm. 1993. р.66]. Необходимость использования селенсодержащих соединений можно рассматривать как основной и существенный недостаток химического метода получения МЕТА, особенно если речь идет о получении МЕТА в промышленном масштабе. Известно, что пары двуокиси селена поражают слизистую оболочку и вызывают ожоги. Аналогично действие и других соединений селена. При этом концентрация всех селенсодержащих соединений в воздухе рабочей зоны не должна превышать предельно допустимой концентрации (ПДК), величина которой составляет 0,1 мг/м³. Следует отметить, что в настоящее время отсутствует быстрый и надежный метод определения столь малой концентрации селена в воздухе [Potin-Gautier H., Casiot С., Abstr.Int.Soc.Trace Elem.Res.Hum. (ISTERH). 5^th Int.Conf., Lyon, Sept., 26-30, 1998, р.351]. Следует отметить также, что химическое дегидрирование требует жестких условий реакции - это кипячение длительное время (8-10 час) в присутствии дегидрирующего агента (как правило, селенистая кислота) при высокой температуре (120°С и выше), что приводит к осмолению реакционной массы и большим потерям при выделении и очистке продукта. Отделение целевого продукта от селенорганики является чрезвычайно трудоемким процессом, включающим многократную обработку тройной солью (смесь Na₂S, Na₂SO₃ и NH₄OH) и надкислотами [Phan Gnoc Kink et al., Rev. Pharm. 1993, p.66].

Микробиологический способ дегидрирования, лишенный перечисленных выше недостатков, является предпочтительным и экологически безопасным.

Известен микробиологический способ получения МЕТА из метиландростендиола (MAT) с помощью Mycobacterium mucosum [Авт.свид. СССР №255264]. Недостатком вышеуказанного микробиологического способа является необходимость применения в процессе ферментации ингибиторов 9α-гидроксилазы - токсичных и плохо удаляемых из конечного продукта солей тяжелых металлов, дипиридила, 8-гидроксихинолина. Только в присутствии указанных ингибиторов получают МЕТА с выходом 70-85%.

Известен также способ получения МЕТА, где исходным субстратом для трансформации служит 3-гидрокси-4-ен- или 5α-Н-субстрат, а в качестве нокардиоподобных бактерий: Mycobacterium phlei [Ахрем А.А., Войшвилло Н.Е. Прикл.биохим.микробиол., 1970, т.6, стр.654]. В указанном способе одновременно с 1,2-дегидрированием происходит расщепление связи С(9)-С(10) в кольце В и образование секо-3,17-диола, что снижает выход конечного продукта.

Другой недостаток известных микробиологических способов, например, заключается в низкой нагрузке исходного субстрата (не более 1 г/л) [Zhang L., Zhang E., Wu Z. Acta Pharm.Sin, 1981, v.16, N5, p.356].

Низкие нагрузки трансформируемых стероидов являются общим недостатком большинства микробиологических методов трансформации. Особенностью стероидных соединений является их низкая растворимость в воде, что и осложняет их превращения. В течение реакции как субстрат, так и продукт большей частью находятся в твердой фазе, в результате чего скорость реакции определяется скоростью растворения гетерогенных частиц субстрата и некоторыми диффузионными факторами. Из-за низкой растворимости субстрат и продукт могут взаимодействовать друг с другом, образуя определенную кристаллическую структуру, что делает субстрат недоступным для дальнейшей трансформации [Kondo F., Masuo M., J.Gen.Appl.Microbiol., 1961, v.7, p.113].

Низкая степень превращения стероидного субстрата, то есть наличие примеси исходного субстрата в конечном продукте, является серьезным препятствием для получения стероидных лекарственных препаратов, в том числе дегидроаналогов, отвечающих требованиям фармакопеи.

Для улучшения диспергирования стероидных субстратов в воде применяют предварительное механическое разрушение частиц стероида, добиваясь при этом наиболее гомогенного распределения частиц по размерам [Патент Великобритании №1211356]. Однако внесение в водную систему гидрофобных порошков требует применения ПАВ. Последние приводят к образованию пены, что затрудняет массообмен и аэрирование системы.

Известен способ получения 1,2-дигидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидов путем трансформации 4-дельта-3-кетостероидов бактериями в присутствии водорастворимых производных бета-циклодекстрина [патент РФ №2156302]. Использование водорастворимых производных бета-циклодекстрина позволило осуществить трансформацию 4-дельта-3-кетостероидов при высоких нагрузках субстрата. Однако получение МЕТА таким способом не описано.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения МЕТА, где дегидрирование 17α-метилтестостерона в МЕТА проводили в присутствии циклодекстрина и искусственного акцептора электронов - менадиона [Патент Великобритании №2108965 А, 1982]. Среди недостатков указанного метода следует отметить низкую концентрацию субстрата - всего 1 г/л. При этом удовлетворительное превращение (97%) наблюдается лишь в присутствии менадиона (10 г/л), токсичного и дорогостоящего реагента. Кроме того, присутствие гидрофобного менадиона в реакционной смеси затрудняет очистку гидрофобного продукта.

Задачей изобретения является создание микробиологического способа получения МЕТА с помощью штаммов микроорганизмов, обладающих 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью, позволяющего упростить процесс и сократить его длительность, увеличить концентрацию субстрата, упростить очистку конечного продукта, увеличить его выход, исключив при этом из способа токсичный и дорогостоящий реагент, что в свою очередь приведет к повышению экологической безопасности способа и удешевлению целевого продукта.

Поставленная задача решается за счет того, что получают метандростенолон способом, включающим микробиологическую трансформацию 17α-метилтестостерона штаммами микроорганизмов, обладающими 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью, в присутствии полимерного материала и последующее выделение из культуральной жидкости целевого продукта, в качестве полимерного материала используют поливинилпирролидон.

Причем в качестве микроорганизмов, обладающих 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью, используют штаммы Arthrobacter globiformis 193, Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632, Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1014.

В результате экспериментального изучения многочисленных полимерных материалов, в том числе и химически модифицированных β-циклодекстринов, неожиданно оказалось, что для проведения процесса дегидрирования МТС наиболее подходит поливинилпирролидон. Применение поливинилпирролидона позволило поднять нагрузку стероидного субстрата до 5-6 г/л (против 1 г/л в прототипе). Этот полимер доступен, достаточно дешев и, кроме того, его можно достаточно просто регенерировать и многократно использовать для проведения ряда последующих трансформаций, что делает предлагаемый способ экологически чистым.

Предлагаемый способ позволил значительно повысить нагрузку исходного субстрата и степень превращения стероидного субстрата за счет образования водорастворимого комплекса "стероид - полимер", значительно упростить процесс трансформации и/или выделения продукта реакции, сократить длительность, повысить выход и экологическую безопасность процесса.

Предлагаемый способ заключается в том, что при получении метандростенолона с помощью микроорганизмов 1,2-дегидрирование 17α-метилтестостерона осуществляют в присутствии солюбилизатора стероидного субстрата - полимерного материала, в качестве которого используют поливинилпирролидон с молекулярной массой 500 кDа. Он растворим в воде, нетоксичен для микроорганизма-трансформатора, позволяют повысить нагрузку токсичного для бактерий 17α-метилтестостерона до 5-6 г/л. Он образует стабильный комплекс включения с целевым продуктом - МЕТА и тем самым устраняется эффект ингибирования продуктом реакции.

Это позволяет проводить процессы трансформации со степенью превращения стероидного субстрата до 95% без добавления менадиона.

Заявляемый способ получения МЕТА состоит в следующем:

Производят микробиологическую трансформацию МТС штаммом, обладающим 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью, в присутствии полимерного материала, в качестве которого используют поливинилпирролидон, с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости. Контроль за ходом ферментации осуществляют с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Подлинность полученного соединения подтверждена с помощью ИК-спектра в сравнении с известным образцом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Культуру Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 выращивали 48 ч на среде следующего состава (%): глюкоза 0,5, пептон - 0,3, дрожжевой экстракт - 1,0, рН 7,0-7,2. Выращенную культуру - посевной материал - переносили в среду, содержащую (%): глюкоза - 1,0, кукурузный экстракт - 1,0, рН 7,0-7,2 и инкубировали 4 ч на качалке, после чего вносили индуктор 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназы.

Через 14-16 ч роста клетки отделяли от среды центрифугированием, промывали 0,01 М K,Na-фосфатным буфером, рН 7,2, суспендировали в том же буфере и использовали для трансформации МТС при нагрузке 6 г/л, приготовленного в виде водного раствора, содержащего 1% поливинилпирролидона с м.м. 500 кDa. Суспензию клеток в растворе МТС переносили в колбы Эрленмейера.

Трансформацию проводили на качалке при температуре 28°С и перемешивании 220 об/мин. Степень превращения МТС в МЕТА согласно данным ВЭЖХ-анализа через 48 ч инкубации в указанных условиях составляла 95-96%.

Метандростенолон выделяли экстракцией культуральной жидкости этилацетатом. Этилацетат упаривали в вакууме, осадок МЕТА отфильтровывали, промывали гексаном и сушили.

МЕТА получен с выходом 85-90%, т.пл. 167-169°С.

Пример 2.

Способ осуществляли по примеру 1, но использовали в качестве культуры Arthrobacter globiformis 193 (коллекция Центра “Биоинженерия” РАН). Степень превращения МТС в МЕТА согласно данным ВЭЖХ-анализа через 50-52 ч инкубации в указанных условиях составляла 95%.

Пример 3.

Способ осуществляют по примеру 1, но используют в качестве штамма-трансформатора Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1014. Степень превращения МТС в МЕТА согласно данным ВЭЖХ-анализа через 50-54 ч инкубации в указанных условиях составляла 94-95%.

Изобретение может быть использовано для получения метандростенолона (метандиенона), широко используемого в медицинской практике при лечении заболеваний, связанных с нарушением белкового обмена, а также при травмах, пластических операциях на костях, в ожоговой терапии, при мышечной дистрофии, хронической коронарной недостаточности, экземах, псориазе, в детской практике при задержке роста, при лечении язвенных, инфекционных и других заболеваний, сопровождающихся потерей белка. В эндокринологической практике это лекарственное средство применяют при гипофизарной недостаточности, хронической недостаточности надпочечников, токсическом зобе, стероидном диабете.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению стероидов. Способ получения метандростенолона (17β-гидрокси-17-метиландроста-1,4-диен-3-он (МЕТА) включает микробиологическую трансформацию 17α-метилтестостерона штаммами микроорганизмов, обладающими 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью. Процесс ведут в присутствии полимерного материала – поливинилпирролидона с последующим выделением целевого продукта. В качестве микроорганизмов используют Arthrobacter globiformis, Pimelobacter simplex или Rhodococcus erythropolis. Способ позволяет увеличить нагрузку на субстрат, упростить процесс и сократить его длительность, упростить очистку конечного продукта, увеличить его выход. Способ экологически безопасен. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения метандростенолона, включающий микробиологическую трансформацию 17α-метилтестостерона штаммами микроорганизмов, обладающими 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью, в присутствии полимерного материала и последующее выделение из культуральной жидкости целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют поливинилпирролидон.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов, обладающих 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназной активностью, используют Arthrobacter globiformis , Pimelobacter simplex , Rhodococcus erythropolis.