ШТАММ PIMELOBACTER SIMPLEX, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СТЕРОИД-1,2-ДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2003 года по МПК C12P33/00 C12N9/04 C12P33/00 C12R1/06 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно касается получения стероидных медицинских препаратов с использованием микроорганизмов.

Целью изобретения является получение нового эффективного штамма бактерий, способного вводить 1,2-двойную связь в Δ⁴-3-кетостероиды или в Δ⁵-3-β-гидроксистероиды с образованием кросс-сопряженной системы в кольце А стероидной молекулы, обеспечивающей высокую биологическую активность стероидных медицинских препаратов прегнанового и андростанового рядов, а также соединений ряда холестана, являющихся ключевыми продуктами в их синтезе.

Процессы микробиологических трансформаций стероидных соединений, как и штаммы микроорганизмов, осуществляющие эти процессы, описаны в научной и патентной литературе [1-8]. Ряд микробиологических трансформаций стероидов имеет большое практическое значение, поскольку позволяет производить лекарства стероидной структуры. К такому ряду относится 1.2- дегидрирование стероидов, приводящее к образованию Δ^1,4-3-кетостероидов и осуществляемое, как правило, с помощью некоторых видов бактерий родов Arthrobacter, Bacillus, Bacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus [1-3]. Чаще всего для проведения 1,2-дегидрирования используют различные штаммы вида Arthrobacter simplex (синоним Pimelobacter simplex) [9].

Трансформацию Δ⁴-3-кетостероидов в Δ^1,4-3-кетостероиды с помощью штаммов Arthrobacter simplex осуществляют, применяя либо растущие в питательной среде клетки микроорганизма-трансформатора [4, 5], либо используя сухие клетки, полученные в результате обработки микробной биомассы ацетоном, или сушкой ее в вакууме при 55^oС [6-8].

Недостатком использования растущих клеток является то, что в процессе трансформации одновременно с 1,2-дегидрированием происходит и нежелательное расщепление колец стероидной молекулы. Для того, чтобы избежать потерь стероидного субстрата, связанных с этим явлением, ферментацию проводят, добавляя к питательной среде соли тяжелых металлов, например сернокислый кобальт. Его вносят в количестве 0,04-1,6 г на 1 л культуральной жидкости в зависимости от загрузки трансформируемого стероида [4, 5].

Когда для 1,2-дегидрирования берут высушенные клетки, преимущество которых перед растущими клетками показано в [8], тогда возникает необходимость в экзогенном акцепторе электронов, в качестве которого чаще всего применяют менадион (2-метил-1,4-нафтохинон). Указанный дорогостоящий акцептор электронов добавляют к реакционной смеси в количестве до 40 г на 1 кг трансформируемого стероида [6-8].

Наиболее близким по сущности к заявляемому штамму является штамм Arthrobacter simplex ATCC 6946, обладающий 1,2-дегидрогеназной активностью [8]. С помощью этого штамма выполнено превращение ряда Δ⁴-3-кетостероидов в 1,2-дегидростероиды. Процесс 1,2-дегидрирования стероидов проводят с помощью клеток, предварительно высушенных в вакууме в течение суток при температуре 55^oС. Высушенные клетки хранят при температуре 5^oС. Срок хранения не указан. Сухие клетки (10 г/л) суспендируют в фосфатном буфере, в который добавляют стероидный субстрат с нагрузкой до 2,5 г/л и экзогенный акцептор электронов менадион в количестве 86 мг/л. С целью эффективной эмульсификации нерастворимых в воде стероидных субстратов, их вносят в реакционную смесь в диметилформамиде.

Недостатками описанного в [8] процесса являются:
- необходимость предварительного высушивания клеток в вакууме, усложняющего технологический процесс;
- использование дорогостоящего экзогенного акцептора электронов, необходимого при использовании убитых нагреванием до 55^oС клеток микроорганизма;
- применение органического растворителя для повышения эмульсификации стероидного субстрата.

Преимущества заявляемого штамма Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 состоит в следующем:
- штамм используется в виде живых клеток;
- штамм не теряет 1,2-дегидрогеназную активность при замораживании клеток и хранении при температуре от -10 до -20^oС в течение 1 года;
- отсутствует необходимость использования экзогенного акцептора электронов;
- отсутствует необходимость использования органического растворителя.

Кроме того, отличительной особенностью данного штамма бактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 является способность синтезировать в процессе размножения в питательной среде экзополисахариды, которые облегчают необходимый для трансформации молекул гидроксистероидов контакт частиц указанных стероидов с клеткой бактерии-катализатора.

Указанный штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 отличается от прототипа так же широкой специфичностью и способен одинаково эффективно превращать в Δ^1,4-3-кетостероиды стероидные соединения как с Δ⁵-3β-гидроксигруппировкой, так и с Δ⁴-3-кетогруппировкой.

Таким образом, заявляемый штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 представляет интерес как перспективный катализатор процессов модификации стероидов, в частности как катализатор реакции 1,2-дегидрирования прегнанов, в результате которой получают Δ^1,4-3-кетостероиды с кортикоидной активностью.

Для селекции высокоэффективного штамма, осуществляющего 1,2-дегидрирование Δ⁴-3-кетостероидов и Δ⁵-3β-гидроксистероидов в качестве исходной родительской культуры использован выделенный из почвы штамм бактерий 39, проявляющий стероид-1,2-дегидрогеназную активность в отношении стероидов.

Исходная культура была подвергнута чередующемуся воздействию физических (УФ-облучение), химических и (нитрозогуанидин) мутагенных факторов. Селекция штамма проведена путем ступенчатого отбора индуцированных мутантов, в результате которого получен новый стероидтрансформирующий штамм с высокой 1,2-дегидрогеназной активностью.

Новый штамм идентифицирован в Центре "Биоинженерия" РАН на основании физиологических, морфологических и культуральных признаков как Pimelobacter simplex [9].

Штамм Pimelobacter simplex депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ Ас-1632 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Морфологические признаки. В молодой культуре - мелкие палочки неправильной формы 0.4-0.8•1.0-5.0 мкм; старые культуры представлены кокковидными клетками 0,4-0,8 мкм. Грамположительные, неподвижные, аэробные, неспорообразующие. Колонии на МПА или кукурузно-глюкозном агаре гладкие, круглые, пастообразные, желтовато-белые. Оптимальная температура для роста 25-30^oС.

Культуральные признаки. Не требователен к составу среды. Разжижает желатину. Усваивает глюкозу, ацетат, сукцинат, цитрат.

Генетические особенности штамма.

Штамм является прототрофом. Штамм является непатогенным для теплокровных животных.

Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 способен осуществлять 1,2-дегидрирование Δ⁴-3-кетостероидов и Δ⁵-3β-гидроксистероидов с концентрацией 1-6 г/л с образованием целевых Δ^1,4-3-кетостероидов в концентрации до 6 г/л.

Использование штамма Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример.

Культуру Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632, в возрасте 7-10 дней, полученную на твердой кукурузно-глюкозной агаровой среде, следующего состава, г/л: глюкоза - 10, кукурузный экстракт - 10, агар-агар - 25, вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,0 переносят в жидкую кукурузно-глюкозную среду (без агара) и инкубируют в колбах на качалке при 30^oС и перемешивании со скоростью 220 об/мин в течение 6 ч, после чего в культуральную жидкость добавляют стероидный индуктор фермента 1,2-дегидрогеназы и продолжают инкубацию в прежних условиях в течение 14-18 ч. Биомассу отделяют от культуральной жидкости, переносят в буферный раствор, к которому добавляют водную суспензию стероида (размер частиц не более 15-20 мкм). Трансформацию осуществляют при температуре 28-30^oС в аэробных условиях и интенсивном перемешивании в течение 6-20 часов. Содержание продукта трансформации оценивалось по данным ВЭЖХ анализа. Данные приведены в таблице.

Источники информации
1. А.А. Ахрем, Ю.А. Титов. Стероиды и микроорганизмы. Наука, М., 1970.

2. S. B. Mahato, S. Banerjee, and S. Podder "Phytochemistry", 1989, 28. p.7.

3. W. Charney, H.L. Herzog "Microbial transformation of steroids", 1967. Academic Press, N-Y&London
4. Weber A., Kennecke M. US Pat. 4839282 C1, 435-61.

5. Weber A., Kennecke M., Muller R. US Pat. 4431732 C1, 435-61.

6. Kominek L.A., Holly J.W. US Pat. 4524134 C1, 435-61.

7. Evans T.W. US Pat. 4684610 C1, 435-61.

8. Kominek L.A., Holly J.W. US Pat. 4704358 C1, 435-61.

9. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, Baltimore, Williams & Wilkins, A Waverly Co., v.2, P.588, 605.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологическому получению Δ^1,2-кортикостероидов. Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ас - 1632 способен вводить 1,2-двойную связь в Δ⁴-3-кетостероиды или в Δ⁵-3β-гидроксистероиды прегнанового ряда с образованием кросс-сопряженной системы в кольце А стероидной молекулы. Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 обеспечивает проведение трансформации с нагрузкой исходного стероида до 6 г/л конверсией в целевой продукт до 99% без применения солюбилизаторов. Штамм Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 обладает широкой специфичностью и является перспективным катализатором процессов модификации стероидов. 1 табл.

Штамм бактерий Pimelobacter simpleх ВКПМ Ас-1632, проявляющий стероид-1,2-дегидрогеназную активность.