СПОСОБ ОЦЕНКИ СПЕКТРА ЖИРНЫХ КИСЛОТ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот в биологических жидкостях организма.

В настоящее время применяется способ определения жирных кислот по методу Синяк К.М., Оргель М.Я., Крук В.И. (Метод приготовления липидов крови для газохроматографического исследования.//Лаб. дело. - 1976. - №1. - с.37-41), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов на водяной бане при 80°С в течение 20 минут, затем проводят газохроматографический анализ полученных метиловых эфиров жирных кислот на газовом хроматографе “Цвет-110” с пламенно-ионизационным детектором. Анализ проводится на стеклянной колонке с неполярной неподвижной фазой 1% SE-30 на хромосорбе DMCS при температуре термостата колонки с программированием от 120 до 240°С.

Однако этот способ имеет ряд недостатков: недостаточный количественный выход жирных кислот, в частности линолевой и линоленовой, и вследствие этого трудности в их количественном подсчете; неполное разделение жирных кислот пальмитиновой и пальмитоолеиновой; стеариновой и олеиновой; отсутствие разделения олеиновой, линолевой и линоленовой кислот.

Задача изобретения: повышение чувствительности способа путем увеличения количественного выхода и расширения спектра определения жирных кислот.

Поставленную задачу решают за счет того, что гидролиз и метилирование жирных кислот проводят во влажной камере в течение 6 часов с их разделением с помощью неподвижной полярной фазы 20% диэтиленгликольсукцината на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Для анализа используют 0,5 мл сыворотки крови. Выделение общих липидов сыворотки крови осуществляют так же, как и в прототипе, хлороформ-метанольной смесью в соотношении 2:1, объемом 10 мл по методу Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J.Biol.Chem. - 1957. - V.226, - P.497-509). После выпаривания нижнего слоя, содержащего экстрагированные липиды в хлороформе, в токе газообразного азота проводят этап метилирования с одновременным гидролизом липидов с целью получения летучих продуктов, анализируемых на газовом хроматографе. Для этого сухой липидный экстракт, разведенный в 0,5 мл хлороформа, переносят в виалы, снабженные герметически закрывающимися крышками, куда добавляют 2 мл метанола и 0,1 мл серной кислоты (особо чистой). Пробы плотно закрывают крышками, помещают во влажную камеру и переносят в сушильный шкаф на 6 часов при температуре 80°С. Через 6 часов в охлажденную метилированную пробу добавляют 2 мл гексана и 1 мл дистиллированной воды. Пробу отстаивают в течение 30 мин, затем собирают верхний слой, содержащий метилированные жирные кислоты в гексане, переносят в остроконечную колбу и высушивают досуха в токе газообразного азота на водяной бане при температуре 37°С.

Для анализа метиловых эфиров жирных кислот общих липидов сыворотки крови используют газовый хроматограф “Хром-5” (Чехословакия). Для этого в образец добавляют 0,1 мл гексана, из полученного объема в инжектор хроматографа вносят 5 мкл пробы. Температура термостата колонки - 180°С. Режим - изотермический. Для анализа используют стеклянную колонку с внешним диаметром 5 мм, внутренним - 3 мм и длиной 250 см, наполненную полярной жидкой фазой 20% диэтиленгликольсукцинат на хроматоне N-AW-DMCS. Идентификацию жирных кислот проводят с использованием стандартной смеси жирных кислот в концентрации 1 мкг/мл гексана по времени удерживания каждой жирной кислоты (производство стандартов метиловых эфиров жирных кислот фирмы “Serva”, Германия).

На схеме А по методу Синяк К.М. и соавт. (1976) показан выход 9 жирных кислот: лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, пальмитоолеиновая, стеариновая, эйкозодиеновая, эйкозотриеновая и арахидоновая. Одним пиком без разделения показан выход олеиновой, линолевой и линоленовой кислот, которые не могут быть дифференцированы. На схеме видно, что выход и разделение жирных кислот пальмитиновой и пальмитоолеиновой, стеариновой и олеиновой неполные. Кроме того, возникают трудности в идентификации жирных кислот, так как на неполярных жидких фазах, которой является 1% SE-30, кислоты выходят по молекулярной массе. В данном случае из-за незначительной разницы в молекулярной массе кислот С:18-ряда, к которому относятся стеариновая, олеиновая, линолевая и линоленовая, их разделение практически невозможно.

На схеме Б представлен выход 16 жирных кислот, определяемых по предлагаемому нами способу: лауриновая, миристиновая, пентадекановая, пальмитиновая, пальмитоолеиновая, гептадекановая, гептадеценовая, стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, арахиновая, эйкозеновая, эйкозодиеновая, эйкозотриеновая, арахидоновая. Из схемы видно, что достигнуто полное разделение этих жирных кислот, улучшен их выход, а также идентификация. Выход жирных кислот по сравнению с прототипом возрос в 1,8 раз за счет дополнительного количества выделенных кислот: пентадекановой, гептадекановой, гептадеценовой, олеиновой, линолевой, линоленовой, эйкозановой, эйкозеновой и эйкозодиеновой кислот.

В таблице представлена сравнительная характеристика выхода жирных кислот в существующем и предлагаемых способах, выраженная в площади каждого пика (мм²).

Из таблицы видно, что количественный подсчет каждой жирной кислоты, в сравнении с прототипом, возрос от 2 до 13,7 раз за счет полного разделения пальмитиновой, пальмитоолеиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, линоленовой, эйкозотриеновой и арахидоновой кислот.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет:

1) расширить спектр выхода жирных кислот в 1,8 раз за счет дополнительного количества выделенных жирных кислот: пентадекановой, гептадекановой, гептадеценовой, олеиновой, линолевой, линоленовой, эйкозановой, эйкозеновой и эйкозодиеновой кислот;

2) повысить количественный уровень выхода жирных кислот в 2-13,7 раз за счет полного разделения пальмитиновой, пальмитоолеиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, линоленовой, эйкозотриеновой и арахидоновой кислот.

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот в биологических жидкостях организма. Способ включает обработку крови хлороформ-метанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим растворителем, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического разделения жирных кислот, при этом гидролиз и метилирование липидов проводят во влажной камере в течение 6 часов, обработку охлажденной метилированной пробы проводят в течение 30 минут в присутствии гексана и дистиллированной воды, а газохроматографическое разделение жирных кислот осуществляют с помощью неподвижной полярной фазы 20% диэтиленгликольсукцината на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С. Технический результат: повышение чувствительности способа путем увеличения количественного выхода и расширения спектра определения жирных кислот. 1 табл., 1 ил.

Способ получения липидов крови для газохроматографического анализа спектра жирных кислот, включающий обработку крови хлороформ-метанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим растворителем, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического разделения жирных кислот, отличающийся тем, что гидролиз и метилирование липидов проводят во влажной камере в течение 6 ч, обработку охлажденной метилированной пробы проводят в течение 30 мин в присутствии гексана и дистиллированной воды, а газохроматографическое разделение жирных кислот осуществляют с помощью неподвижной полярной фазы 20% диэтиленгликольсукцината на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С.