СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И РАЗДЕЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот (ЖК) в биологических тканях организма.

Известен способ оценки спектра ЖК (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов во влажной камере в течение 6 часов с разделением ЖК с помощью полярной жидкой фазы 20% диэтиленгликольсукцината (ДЭГС) на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С. Однако этот способ имеет недостаточную чувствительность регистрации жирных кислот при их низком содержании в тканях организма.

Задача изобретения: повышение чувствительности определения и разделения ЖК.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС, после промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС: жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, после этого проводят продувку колонки азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, гидролиз и метилирование проводят в течение 3 часов с разделением жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината, нанесенного на капиллярную колонку, при температуре колонки термостата 140°С.

Способ осуществляют следующим образом.

Для анализа используют 0,5 мл плазмы крови, эритроцитов, тромбоцитов. Выделение общих липидов плазмы крови осуществляют так же, как и в способе оценки жирных кислот (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, объемом 10 мл по методу Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem, - 1957. - V.226. - P.497-509). После выпаривания нижнего слоя, содержащего экстрагированные липиды в хлороформе, в токе газообразного азота проводят этап метилирования с одновременным гидролизом липидов с целью получения летучих продуктов, анализируемых на газовом хроматографе. Для этого сухой липидный экстракт, разведенный в 0,5 мл хлороформа, переносят в виалы, снабженные герметически закрывающимися крышками, куда добавляют 2 мл метанола и 0,1 мл серной кислоты (особо чистой) и перемешивают. Пробы плотно закрывают крышками, помещают во влажную камеру и переносят в сушильный шкаф на 3 часа при температуре 80°С. Через 3 часа в охлажденную метилированную пробу добавляют 2 мл гексана и 1 мл дистиллированной воды. Пробу отстаивают в течение 30 мин, затем собирают верхний слой, содержащий метилированные эфиры жирных кислот в гексане, переносят в остроконечную колбу и высушивают досуха в токе газообразного азота на водяной бане при температуре 37°С.

Приготовление капиллярной колонки с полярной жидкой фазой диэтиленгликольсукцинат (ДЭГС): используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м. Перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС. После промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС. При этом жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота. Затем растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм. После этого проводят продувку азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С.

Для анализа метиловых эфиров жирных кислот общих липидов плазмы крови используют газовый хроматограф «Кристалл 2000 М». Для этого в образец добавляют 0,05 мл гексана, из полученного объема в инжектор хроматографа вносят 1 мкл пробы. Использовали режимы термостата колонки 140, 180 и 200°С. Идентификацию жирных кислот проводят с использованием стандартной смеси жирных кислот в концентрации 1 мкг/мл гексана по времени удерживания каждой жирной кислоты (производство стандартов метиловых эфиров жирных кислот фирмы «Serva», Германия).

В таблице 1 показана зависимость уровня регистрации ЖК от температуры колонки.

Таблица 1
Зависимость уровня регистрации ЖК плазмы крови человека от температуры термостата колонки в предлагаемом способе.Название ЖКСодержание ЖК выражено площадью, мм²температура 180°C.температура 140°C.температура 200°С.Лауриновая0,801±0,21511,93±5,62*Не определяетсяМиристиновая2,263±0,4920,001±0,0004**Не определяетсяПальмитиновая53,126±11,15969,68±14,31**40,68Пальмитолеиновая0,016±0,00512,97±3,34*5,56Стеариновая6,851±1,35314,21±0,92***1,34Олеиновая9,177±1,97834,84±2,26***36,92Линолевая16,61±2,87326,94±1,56***Не определяетсяЛиноленовая0,627±0,3331,03±0,88Не определяетсяЭйкозеновая0,991±0,3684,99±1,32*Не определяетсяЭйкозотриеновая1,165±0,24618,71±4,41**14,67Арахидоновая0,801±0,3494,62±1,54*1,62Эйкозопентаеновая6,511±2,07546,14±12,47*7,14Докозогексаеновая1,055±0,4130,86±0,295,9Общая площадь99,995246,92113,83

Примечание:

Как показывают результаты таблицы 1, температура 140°С термостата колонки наиболее оптимальна по сравнению с 200°С и 180°С для разделения и регистрации ЖК. Общий уровень при температуре 140°С, по сравнению с другими температурными режимами, в 2,2-2,5 раз соответственно выше (Табл.1, общая площадь)

На фиг.1. отображена хроматограмма ЖК на стеклянной колонке с диэтиленгликольсукцинатом на хроматоне N-AW-DMCS. При разделении и регистрации ЖК в количестве, эквивалентном их содержанию в 10 мкл плазмы или при разведении в 100 раз, показана идентификация 5 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой. Совсем не идентифицируются при данном разведении эйкозеновая, эйкозотриеновая, арахидоновая, эйкозопентаеновая и докозогексаеновая ЖК.

На фиг.2. отображена хроматограмма ЖК на капиллярной колонке с диэтиленгликольсукцинатом. При определении той же концентрации ЖК показана идентификация 10 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, пальмитолеиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, арахидоновой, эйкозопентаеновой и докозогексаеновой. То есть по предлагаемому способу при данном разведении идентифицируется в 2 раза больше ЖК.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика определения эквивалентных количеств жирных кислот в прототипе и предлагаемом способах, выраженная в площади каждого пика (мм²). Из таблицы видно, что количественный уровень регистрации ЖК, в сравнении с прототипом, возрос от 5,33 до 615,22 раз. В целом чувствительность предлагаемого нами способа возрастает в среднем в 34,95 раза.

Таблица 2
Сравнительная характеристика определения жирных кислот плазмы в существующем и предлагаемом способах (мм²)Название ЖКПрототипПредлагаемый способСоотношение уровня регистрации жирных кислотЛауриновая0,012±0,0030,801±0,215*66,75Миристиновая0,012±0,0022,263±0,492**188,58Пальмитиновая2,198±0,95753,126±11,15**24,17Пальмитолеиновая0,003±0,0010,016±0,005*5,33Стеариновая0,015±0,0056,851±1,353**456,66Олеиновая0,250±0,1069,177±1,978**36,7Линолевая0,027±0,01716,611±2,873*615,22Линоленовая0,003±0,0020,627±0,333**209Эйкозеновая0,143±0,1420,991±0,318**6,93Эйкозотриеновая0,064±0,0271,165±0,246*18,2Арахидоновая0,080±0,0350,801±0,349*10,1Эйкозопентаеновая0,035±0,0106,511±2,075*186,02Докозогексаеновая0,019±0,0061,055±0,413*55,52Общая сумма2,86199,9934,95Примечание:
В таблице приведены средние данные по ЖК плазмы, взятой от 5 человек. Достоверность отличий предлагаемого способа от существующего р<0,05 - *; р<0,01 - **.

В таблице 3 показана возможность определения спектра ЖК предлагаемым способом в других тканях организма: эритроцитах, тромбоцитах.

Таблица 3
Возможность определения жирных кислот предлагаемым способом в других тканях организма.Название ЖКРегистрируемый уровень ЖК в площади, мм²ЭритроцитыТромбоцитыЛауриновая26,40516,45Миристиновая33,9927,13Пальмитиновая19,0810,8Пальмитолеиновая0,980,01Стеариновая3,512,53Олеиновая3,583,15Линолевая4,241,67Линоленовая1,701,4Эйкозотриеновая7,701,63Арахидоновая0,010,01Эйкозопентаеновая2,241,69Докозогексаеновая4,171,23Общая площадь107,60567,7Примечание: Уровень ЖК определяется в пробах, содержащих 9,42·10⁷ эритроцитов, 75,2·10⁵ тромбоцитов, при температуре термостата колонки 140°С.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения и разделения ЖК в биологических тканях организма в среднем в 34,95 раз.

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот (ЖК) в биологических тканях организма. Способ включает обработку крови хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С в течение 3 часов, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината (ДЭГС), нанесенного на колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м при температуре термостата колонки 140°С. Колонку перед нанесением на нее ДЭГС многократно промывают хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, ДЭГС наносят на внутреннюю стенку капиллярной колонки динамическим методом так, что толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, затем проводят продувку колонки азотом 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С. Способ позволяет повысить чувствительность определения и разделения ЖК в биологических тканях организма в среднем в 34,95 раз. 2 ил., 3 табл.

Способ определения и разделения жирных кислот в биологических тканях крови организма, включающий обработку крови хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината (ДЭГС), нанесенного на колонку, отличающийся тем, что гидролиз и метилирование липидов проводят в течение 3 ч, для газохроматографического определения и разделения жирных кислот используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, которую перед нанесением на нее ДЭГС многократно промывают органическими растворителями хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, ДЭГС наносят на внутреннюю стенку капиллярной колонки динамическим методом, при котором жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную колонку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, где толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, затем проводят продувку колонки азотом 5-6 ч на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, а газохроматографическое определение и разделение жирных кислот осуществляют при температуре термостата колонки 140°С.