Способ получения моноклональных антител к легким @ -Цепям иммуноглобулинов человека Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

О) ел

Изобретение относится к биотехно- логин и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний Человека,

Целью изобретения является повы- ;шение чистоты целевого продукта.

Для осуществления способа используют штамм гибридных клеток 1G5G7 или 5B4D6-I.

Штамм IG5G7 получают следующим образом.

Мышей линии BALE /с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких 7i цепей человека, выделенных из мочи (белки Бенс Джонса), в 0,5 м физиологического раствора, забуферен него фосфатами (ЗФР), 5 мм Na-фосфат ный буфер, рН 7,2-7,4, 150 мМ NaCl, без адъюванта. Иммунизацию повторяют через 40 дней, вводя внутрибрюшинно 100 мкг легких цепей (препарат LAHT) в ЗФР без адъюванта. Через три дня после этого 11 О клеток селезенки иммунных гибридизи™ руют с 6-10 клеток миеломы мыши X63 Ag8-653 с помощью 0,4 мл 4,5% ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 2000, содержащего 10% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмьшки клеток от ПЭГа, клетки высевают в 96 луноч- ные панели по 2-10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RP KI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 1 ей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 41 О М аминоптерина 10

теляч-4

и содержащую 410 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100% субклонов-продуцируют антитела к легким -цепям человека. Наиболее продуктивный штамм выводят в массовую культуру и обозначают IG5G7.

s

0

ная доза 100 тыс. кл/мл, клетки пас сируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10, культура суспензионная. с Для выращивания асцита пригодны мыши BALB/C. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъе.цируют внутрибрюшинно по 2- 0 510 кл/мл среды Игла. Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклональнык антител (МА) на 3-4-и день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции. К моменту депонирования штамм прошел более 20 пассажей in vitro. Продукция МА сохраняется как минимум до 20 пассажей in vitro и до 3 пассажей в асцитной форме. I Характеристика полезного продукта.

МА относятся к классу IgGI.Oни специфически взаимодействуют с легкими Х-цепями иммуноглобулинов человека.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тими- диновой метки, Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 4°С/мин до +4°С, затем 1 С/мин до -40°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию три5

0

5

0

Штамм IG5G7 хранится в Специализи

рованной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института ЦИТОЛОГИИ- АН СССР под номером ВСКК (njf 75D и характеризуется следющими признаками.

Культуральные признаки.

Среда культивирования: среда RPMI 1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сьшоротки, 4 мМ глютамина 100 мгк/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ меркаптозта- нола при 37°С в атмосфере 5% углекислоты. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду; посев

Пановым синим.

Штамм 5B4D6-I получают следующим образом.

Мьш1ей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг легких А -цепей человека, вьщеленных из мочи -(белки Бенс-Джонса), в 0,5 мл физиологического раствора, за- буференного фосфатами, 5 мМ Na-фосфат- ный буфер, рН 7,2-7,4, 150 мМ NaCl, без адъюванта. Иммунизацию повторяют через 40 дней, вводя внутрибрюшинно 100 мкг легких 2 -цепей (препарат ТАИТ) в ЗФР без адъюванта. Через три

- Л

дня после этого 1.10. клеток селезенки иммунных мышей гибридизируют с 6-10 клеток миеломы мьши X63 Ag8-653 с п6моп;ью 0,4 мл раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 2000, содержащего 10% диметилсульфок- сида, в течение 1 мик. После гибридизации и отмьшки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по к 10 клеток в лунку. .Для культивиро- вания и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, , 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М ти

высевая по

щую 4-10 клеток

мидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений,

1 клетке в лунку, содержа

селезенки. После

двух клонирований практически 100% 20 субклонов продуцируют антитела к легким Л -цепям человека. Наиболее продуктивный клон вьгоодят в массовую культуру и обозначают 5B4D6 -.

Штамм 5B4D6-I хранится в Специали- 25 зированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 73D и характеризуется следующими признаками., 3Q

Культуральные признаки.

Среда культивирования:.среда RPMI- 1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сьгооротки, 4 мМ Ь-глутами на, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% углекислоты. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду, посевная доза 100 тыс. кл/мл; клетки дО пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10, культура суспензионная.

Для выращивания асцита пригодны мьш1и BALB/C. Кыгаам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внут 45 рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 10 кл/мл среды Игла. Асцит формиру- , ется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклональных антител на 3-4-и день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости при определении методом торможения радио- иммуноадсорбции. К моменту депонирования штамм прошел более 20 пассажей in vitro. Продукция MA сохраняется

15

16509

как минимум до 20 пассажей in vitro и до 3 пассажей в асцитной форме. Характеристика полезного продукта. с МА относятся к классу Ip.GI. Они специфически взашчодейств тот с легкими Л -цепями иммуноглобулинов человека. Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительQ НОМ наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой . не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки. Кркоконсервирова5 ние. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 4 С/мин до +4 С, затем 1 С/мин - до -40°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят на водяной бане при Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

I

Пример. Гибридные клетки штаммов 1G5G7 и 5B4D6-I помещают в

rt

пластиковые флаконы площадью 25 см по 5-10 клеток в 5 мл среды RPMI- 1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой,4 мМ глютамина,100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивирут т 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5% COj. Полученные супернатан- ты используют в качестве реагентов в иммунохимических реакциях (как препараты МА) .

На полистирольные 96-ячеечные пагс нели для микротитрования сорбируют антиген - 2 мкг на ячейку в 100 мкл ЗФР при 4°С в течение ночи. После насыщения панелей 0,05%-ным раствором Твин-20 в для уменьшения неспеци фического связьшания антител с плас тиком в ячейки вносят по 100 мкл , культуральной среды штамма 1G5G7 и инкубируют 1 ч при 2Q С. После этого .панель отмьгоают три раза по 250 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и вносят кроличьи антимьшзиные антитела, меченые 1 (препарат с удельной активностью 0,8-10 срм на мкг, 0, на ячейку в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20). После инкубации в течение 1 ч при 20°С панель трижды промывают ЗФР с 0,05%-ным и просчитьтают на счетчике.

1А16509

Результаты исследований представлены в таблице (цифры в таблице при ведены за вычетом фона неспецифичес кой сорбции, определяемой по сорбции меченных антител после инкубацииантиге- на с нормальными иммуноглобулинами мьгаш.

Результаты, представленные в таё лице, свидетельствуют о высокой специфичности полученных МА по отношению 0 с я тем, что, с целью повышения чиск легким Т( -цепям иммуноглобулинов человека. Повышение чистоты моноклональных антител достигается тем, что для получения гибридов используют непродуцирутощую иммуноглобулины миеломную линию Х63-Ag8-653,

рмула и

6

3 о

бретения

Способ получения моноклональных антител к легким Л -цепям иммуноглобулинов человека путем выращивания гибридомы в питательной среде с по следующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающий

тоты целевого продукта, в качестве гибридомы используют гатамм гибридных культивируемых клеток животных MuSt musculus ВСКК (П) N 75D или штамм

.... - -1

гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus ВСКК (П) N 73D.