СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАПСУЛЬНОГО ВЕЩЕСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА Российский патент 2004 года по МПК A61K39/104 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине и касается получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - одного из основных факторов вирулентности, обусловливающего устойчивость микроба к фагоцитозу, которое может использоваться в качестве иммунологического компонента для выявления капсулообразования у микробных клеток и оценки воздействия на иммунную систему макроорганизма.

Известны различные способы выделения поверхностных антигенных комплексов различных грамотрицательных микроорганизмов, в том числе представителей родов Pseudomonas и Burkholderia. Так, известен способ выделения поверхностного макромолекулярного комплекса Pseudomonas aeruginosa с очисткой методом гель-хромагографии основного компонента глико-протеина, обладающего летальной и антифагоцитарной активностью (Pier G., Cohen M., Jennings H. Futher purification and characterization of high-molecular-weight polysaccharide from Pseudomonas aeruginosa//Infect. Immun. - 1983. - V.42. - P.936-941).

Известны также способы выделения поверхностных веществ из микробных клеток В. pseudomallei. Так, выделен и охарактеризован протективный поверхностный гликопротеин возбудителя мелиоидоза (Патент РФ №2109520 "Способ получения протективного гликопротеина возбудителя мелиоидоза"). Имеется патент на технологию получения поверхностного антигена 8 возбудителя мелиоидоза, обладающего выраженным антифегоцитарным действием (Патент РФ №2004250 "Способ выделения антигена 8 возбудителя мелиоидоза". Однако в известных аналогах описаны приемы выделения и очистки поверхностных антигенных комплексов, не позволяющих получить истинный спектр биополимеров, входящих в капсулу возбудителя мелиоидоза, так как объективного контроля капсулопродукции микробных клеток не предусматривалось.

Наиболее близким решением является способ получения слизистой субстанции возбудителя мелиоидоза, преимущественно углеводной природы, пригодной для иммунохимических и иммунологических исследований (Денисов И.И. Полисахаридный компонент слизи Pseudomonas pseudo-mallei//Жypн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1985. - №11. - С.23-26).

В прототипе автором предложена технология получения поверхностного слизистого вещества возбудителя мелиоидоза, заключающаяся в механической обработке стеклянными бусами прогретой при 56°С трехсуточной агаровой культуры микробных клеток с последующим центрифугированием гомогената и осаждением материала из супернатанта охлажденным этанолом. Приготовленный таким образом препарат пригоден для иммунохимических и иммунобиологических исследований. Однако в силу технологических особенностей он потенциально контаминирован биополимерами клеточных мембран, цитозоля и некоторых других структур. Кроме того, и это самое главное, не учитывается и не контролируется капсулопродукция клеток возбудителя мелиоидоза.

В то же время проведение специфических иммунохимических и иммунологических исследований требует наличия истинного капсульного вещества возбудителя мелиоидоза, максимально сохранившего структурные и биологические свойства.

Целью изобретения является получение полного набора биополимеров, входящих в капсулу возбудителя мелиоидоза, с максимальным сохранением их иммунобиологических свойств.

Цель достигается тем, что бактериальную массу возбудителя мелиоидоза выращивают на питательном агаре (Difco) pH 6.8 с добавлением 4% глицерина и 1.5% нормальной козлиной сыворотки при 37°С в течение 24 ч.

Контроль продукции капсупообразования проводят методами световой и электронной микроскопии.

Суточную бактериальную массу смывают с пластинок агара 0.85% раствором NaCl и центрифугируют при 5000 g в течение 10 мин. Сформировавшийся осадок осторожно ресуспендируют в буфере, содержащем 0.75 М сахарозы, 10.0 mM Трис-НСl рН 8.0, 1.5 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Далее микробные клетки 3-кратно отмывают при помощи центрифyгирoвaния пpи 5000 g в тeчeниe 10 мин. Фракции супернатанта объединяют, переосаждают 5-кратным объемом охлажденного ацетона (-30°С) и выдерживают в течение 5 час при 0°С. Осадок отделяют центрифугированием (5000 g, 10 мин), диализуют против 0.05 М фосфатного буфера рН 7.2 с 0.1 М NaCl, концентрируют и используют в иммунологических реакциях. Для иммунохимических исследований полученный препарат ресуспендируют в буфере, содержащем 0.0625 М Трис, 2% додецилсульфата натрия (ДСН), 10% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанола, рН 6.8. Затем препарат прогревают при 100°C в течение 10 мин и используют для электрофоретического анализа. Степень целостности клеток и полноту экстракции с их поверхности капсульного вещества контролируют с помощью электронной микроскопии. Для более полного и дифференцированного изучения иммунологических свойств капсульных биополимеров препарат фракционируют на колонке с TSK HW-60F (Тоуореаrl), уравновешенной 0.05 М фосфатным буфером рН 7.2 с 0.1 М NaCl. Элюцию проводят этой же буферной системой и регистрируют спектрофотометрически при 280 нм В результате получают хроматографические фракции капсульного вещества, обозначенные как K1, К2, К3 и К4.

Полученный вышеописанным способом цельный препарат капсульного вещества возбудителя мелиоидоза представляет собой гетерополимерный комплекс, состоящий из белков м.м. 60-22 кДа, гликопротеинов мм 200-90 кДа и липопротеинов м.м. 20-18 кДа. Хроматографические фракции капсульного вещества (К1, К2, К3 и К4) содержат различные наборы биополимеров, что позволяет дифференцированно оценивать их иммунобиологические свойства.

Пример 1. Подбор условий культивирования возбудителя мелиоидоза для стимуляции процесса капсулообразования.

Используют два варианта выращивания биомассы возбудители мелиоидоза: 1) питательный агар рН 6.8+4% глицерина и 2) питательный агар рН 6.8+4% глицерина+нормальная козлиная сыворотка в количестве 0.75, 1.5 и 3%. Количество капсулообразующих особей оценивают по данным электронной микроскопии. Второй вариант культивирования микроорганизмов оказывается значительно эффективнее первого по капсулопродукции, а оптимальная концентрация добавляемой сыворотки составляет 1.5%. Инкубация возбудителя мелиоидоза с данной концентрацией козлиной сыворотки при 37°С в течение 24 час позволяет получить бакмаосу, содержащую до 40% инкапсулированных микробных клеток, в то время как при добавлении 0.75% сыворотки - до 12%, а при 3% - до 20% (фиг. 1).

Пример 2. Сравнительная оценка эффективности экстракции капсульного вещества.

Для мягкой и достаточно полной экстракции капсульного вещества используют буфер, в который входят 0.3 М сахароза, 10 mM Трис-HCl рН 8.0 и ЭДГА в трех различных концентрациях: 0.75, 1.5 и 3.0 mM. Эффективность экстракции капсульного вещества анализируют при помощи электронной микроскопии, определения общего количества белка, полуколичественных иммунопреципитационных тестов и электофореза в полиакриламидном геле с ДСН и дифференциальным окрашиванием фореграмм нитратом серебра и 0.01% дибензо-диэтил-метил-тиокарбоцианин-бромидом (Serva). Установлено, что после экстракции буфером с 0.75 mM ЭДТА на поверхности микробных клеток при микроскопии наблюдаются значительные фрагменты капсульного вещества Напротив, применение буфера с 3 mM ЭДТА приводит не только к полной экстракции капсулы, но и к заметному повреждению клеточной стенки, что проявляется в контаминации препарата мембранными белками. Буфер с 1.5 mM ЭДТА оказался наиболее оптимальным экстрагеном. Препарат, приготовленный с его помощью, содержит максимальное количества белка, в тестах иммунопреципитации с иммунными сыворотками формирует ряд четких зон преципитата и по данным окрашенных препаратов электрофореграмм представляет собой гетерогенную структуру. Просмотр "отмытых" микробных клеток под электронным микроскопом показывает, что подавляющее большинство их не разрушено, не имеет повреждений клеточной мембраны и, вместе с тем, не содержит на своей поверхности капсульного вещества (фиг. 2).

Пример 3. Подбор хроматографической матрицы для эффективного фракционирования капсульного вещества.

Для более полного изучения иммунохимических и иммунобиолюгических свойств биополимеров, входящих в капсульное вещество, последнее подвергли фракционированию на отдельные составляющие. С этой целью применили "молекулярные сита": Ультрогель АсА-22 (LKB) с пределами фракционирования 100000-1200000 кДа, Сефакрил S-300 (Pharmada) - 10000-1500000 кДа и TSK HW 60 F (Toyopearl) - 5000-1000000 кДа). Колоночная (25×700 мм) гель-хроматография капсульного вещества в одинаковых условиях (элюция 0.05 М фосфатным буфером рН 7.2 с 0.1 М NaCl) позволяет установить, что из примененных гелей значительно лучше происходит разделение на поливиниловой матрице TSK HW 60 F; при этом профиль элюции представлен четырьмя изолированными пиками. Хроматографическая фракция К1 имеет наиболее комплексный биополимерный состав, при окраске серебром выявляются гликопротеины с м.м. 200, 150-90 кДа, протеины 39, 31, 25, 22 кДа с выраженным преобладанием белка 39 кДа. Обнаруживаются также фрагменты ЛПС с м.м. 120-80 кДа 70-40 кДа. В составе фракции К2 выявляются гликопротеины 95-90 кДа и группа белков 39, 31, 25, 22 кДа, а также мажорный низкомолекулярный белок 15 кДа. Фракция К3 содержит протеины 71, 45-30 кДа, 25-22 кДа и гликопротеины 140, 120 кДа. В препарате фракции К4 обнаруживаются протеины 71, 48, 45, и 25 кДа, а также в незначительных количествах гликопротеины 140 и 120 кДа (фиг.3).

Таким образом, оптимальной матрицей для эффективного фракционирования капсульного вещества возбудителя мелиоидоза признана TSK HW 60 F.

Пример 4. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств фракций капсульного вещества возбудителя мелиоидоза.

Оценка гуморального иммунитета при введении отдельных фракций капсульного вещества белым мышам при помощи определения числа АОК выявляет, что препараты К1, К2, К3 достоверно стимулируют антителогенез в отличие от К4, который не только не влияет на гуморальный иммунитет, но и имеет тенденцию к иммунодепреосивному действию.

При оценке влияния фракций капсулы на клеточное звено иммунитета с помощью реакции ГЗТ установлено, что К1, К2 и К3 достоверно снижают уровень ГЗТ, в то время как К4 не оказывает заметного воздействия на формирование ГЗТ. Влияние капсульных фракций на А-звено иммунитета оценили по фагоцитарной активности иммунных перитонеальных макрофагов с помощью хемилюминесцентного метода. Препараты К1, К2, К3 обладают выраженным иммунопотенцирующим действием в отличие от К4, который интенсивно угнетает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (фиг.4). Ни одна из фракций капсулы не обладает заметными протективными свойствами.

Таким образом, подтверждается функциональная значимость капсулы как фактора вирулентности патогенных микроорганизмов. Фракция К4 капсульного вещества возбудителя мелиоидоза обладает весьма выраженными иммунодепрессирующими свойствами, что обеспечивает защиту инкапсулированных микробных клеток при инвазии макроорганизма. В то же время, биополимеры, составляющие фракции К1, К2 и К3, в силу своих иммуномодулирующих свойств могут рассматриваться в качестве компонентов химической вакцины.

Таким образом, предлагаемый способ получения и фракционирования капсульного вещества возбудителя мелиоидоза с помощью приемов стимуляции капсулообразования, экстракции с помощью ЭДТА-буфера и колоночной гель-хроматографии позволяет выделить комплекс биополимеров, входящих в капсулу B.pseudomallei, пригодный для последующего использования в иммунохимических и иммунологических исследованиях.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза. Способ предусматривает выращивание бактериальной массы, экстракцию поверхностных биополимеров клетки и фракционирование экстрагированного вещества. При этом, для увеличения капсулообразования в питательную среду добавляют нормальную козлиную сыворотку в концентрации до 1.5%. Культивирование бактерий проводят в течение 24 часов при 37°С с последующим центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут. Экстракцию биополимеров проводят раствором, состоящим из 0.3 М сахарозы, 10 mM Трис-HCl рН8.0 и 1.5 mM ЭДТА. Далее супернатант объединяют с пятью объемами охлажденного ацетона, экспонируют при 0°С в течение 5 часов и центрифугируют при 5000 g в течение 10 минут. Полученный осадок диализируют против 0.05 М фосфатного буфера рН 7.2 с 0.1 М NaCl и хроматографируют полученное вещество на матрице TSK HW-60F с помощью 0.05 М фосфатного буфера рН 7.2 с 0.1 М NaCl. Предложенный способ позволяет выделять комплекс биополимеров, входящих в капсулу В. pseudomallei, который пригоден для использования в иммунологических и иммунохимических исследованиях. 4 ил.

Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза, включающий выращивание бактериальной массы, экстракцию поверхностных биополимеров микробной клетки, фракционирование экстрагированного вещества, отличающийся тем, что для увеличения капсулообразования в плотную питательную среду (Difco) pH 6,8 с 4% глицерина добавляют нормальную козлиную сыворотку в концентрации до 1,5%, культивируют бактерии в течение 24 ч при 37°C с последующим отмыванием клеток путем центрифугирования при 5000 g в течение 10 мин 0,85%-ным NaCl и экстракцией раствором, состоящим из 0,3 М сахарозы, 10 mM Трис-НСl pH 8,0 и 1,5 mM ЭДТА, трижды отмывают клетки этим буфером, супернатант объединяют, добавляют к нему 5 объемов охлажденного ацетона (-30°C), экспонируют при 0°C в течение 5 ч и центрифугируют при 5000 g 10 мин, осадок диализуют против 0,05 М фосфатного буфера pH 7,2 с 0,1 М NaCl, хроматографируют полученное вещество на матрице TSK HW-60F (Toyopearl) с помощью 0,05 М фосфатного буфера pH 7,2 с 0,1 М NaCl.