N, N-ДИЭТИЛДИТИОКАРБАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ НАТРИЕВАЯ СОЛЬ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2004 года по МПК A61K31/185 A61P37/08 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания фармакологических препаратов с антиаллергическим действием.

Известно использование синтезированных химических соединений, например производных пиридина, пиперидина, пирролидина, пиперазина, фенотиазина, имидазола и других, в препаратах для лечения аллергии (Зарудий Ф.С. Гистамин и противогистаминные средства, г. Уфа, 244с.). Действие этих соединений обусловлено их способностью блокировать H₁-рецепторы важнейшего медиатора аллергии - гистамина. Противогистаминные препараты на основе этих соединений обладают достаточно высокой лечебной эффективностью и получили широкое распространение в противоаллергической терапии.

В то же время, эти соединения обладают рядом побочных нежелательных эффектов, таких как отрицательное действие на сердечно-сосудистую систему, на желудочно-кишечный тракт и на мочевыводящую систему, а также седативное действие, привыкание при длительном применении, которые значительно ограничивают их применение.

Кроме того, в силу недостаточной эффективности или индивидуальной чувствительности к тому или иному противоаллергическому препарату больным приходится подбирать среди известных соединений препарат, приводящий к достижению желаемого терапевтического эффекта. Таким образом, поиск новых средств, воздействующих на различные механизмы аллергического воспаления и предоставляемых в распоряжение больных, имеет важное значение при выборе фармакологического контроля аллергического процесса.

Поэтому в настоящее время становится все более актуальным направленный поиск соединений, способных воздействовать на секрецию различных посредников аллергического ответа, и разработка на их основе новых перспективных направлений фармакологического контроля аллергической реакции.

Аллергическая реакция представляет собой сложный по клеточной организации процесс, включающий множество механизмов активации секреции различных медиаторов аллергии.

Известно, что важнейшие ключевые этапы формирования аллергического процесса связаны с вовлечением в него тучных клеток соединительной ткани и базофильных лейкоцитов периферической крови. Соединение аллергена с антителом на поверхности именно этих клеток запускает цепь тех событий, которые приводят в конечном итоге к важнейшим клиническим проявлениям аллергии.

Известны препараты кромоглициевой кислоты и недокромила натрия (Гущин И.С. “Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль”, М.: Фармарус принт, 1998 г., с.216-222), противоаллергическую активность которых связывают со стабилизирующим действием на клетки-мишени аллергии.

Однако это действие является довольно слабым и проявляется в экспериментальных условиях при высоких концентрациях этих соединений, не имеющих терапевтического значения.

Таким образом, технический результат, получаемый от реализации настоящего изобретения, состоит в расширении группы соединений, обладающих противоаллергическим действием за счет торможения функции клеток-мишеней аллергии и в повышении эффективности фармакологического контроля аллергических воспалений.

Указанный технический результат достигается применением N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевой соли в качестве вещества, обладающего противоаллергическим действием.

N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевая соль (ДЦК) используется в качестве светочувствительного материала с тепловым проявлением (патент DE №2537935, МКИ G 03 С 1/06, оп. 1976 г.). Известно также использование ДДК в качестве ингибитора ферментов (Gushchin I.S. "Some molecular aspects of immediate allergy and its drug control", Sov. Med. Rev., Sec. D, Immunol. Rev. 1992, v.4, p. 1-55).

В результате проведеных исследований с целью выявления взаимоотношений процессов пероксидации в тучных клетках (ТК) и высвобождения медиаторов из этих клеток обнаружено, что ДДК тормозит вызванную веществом 48/80 секрецию гистамина из тучных клеток. Исследования кинетики показателей кислородного метаболизма - ферментативной и неферментативной пероксидации и активности антиоксидантных ферментов в процессе секреции гистамина при активации тучных клеток осуществляли по реакции оксидантно-антиоксидантной системы при действии на тучные клетки ДДК. Из рецепторных неиммунологических активаторов ТК использовали вещество 48/80, взаимодействующее с соответствующими мембранными рецепторами тучных клеток.

Установлено, что ДДК полностью тормозит образование супероксиддисмутазы (СОД), препятствует изменению ее активности и в то же время значительно снижает секрецию гистамина.

N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевая соль может быть получена в результате реакции замещения меркапто-группы N,N-диэтилдитиокарбамата натрия.

Ниже приведен пример получения описываемого соединения.

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и холодильником, загружают 30 мл 85% изопропилового спирта, 0,73 г (0,01М) диэтиламина, 2 г карбамата натрия, массу перемешивают и охлаждают до 0°С. Затем добавляют 0,76 г (0,01М) сероуглерода, массу перемешивают при температуре 0-5°С 20 минут, выпавший осадок отфильтровывают. Получают 1,83 г (81% от расчетного) N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевой соли, представляющей собой белый кристаллический продукт.

Формирование аллергического процесса связано с вовлечением в него тучных клеток слизистых оболочек, соединительной ткани и базофильных лейкоцитов периферической крови. Соединение аллергена с антителом на поверхности именно этих клеток запускает механизм секреции ими медиаторов, вызывающих патофизиологические изменения (сокращение гладкой мускулатуры, повышение сосудистой проницаемости, гиперсекрецию слизи из слизистых желез), составляющие основу клинических проявлений аллергии.

Установлено, что тучные клетки (ТК) и базофильные лейкоциты вовлекаются в аллергические реакции посредством активации их функции, а не в результате их разрушения образующимся комплексом аллерген-антитело.

В соответствии с изобретением обнаружено, что N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевая соль способна воздействовать на аллергический процесс путем подавления активации функций тучных клеток и базофильных лейкоцитов и проявляет тем самым противоаллергическую активность.

Изучение биологической активности описываемого соединения проведено с использованием метода определения высвобождения гистамина из тучных клеток крыс, метода высвобождения гистамина in vitro из базофилов периферической крови человека и метода пассивной кожной анафилаксии in vivo. Исследования предполагают предварительное исключение возможности исследуемых соединений взаимодействовать с реакцией определения гистамина и вызывать в пределах испытываемых концентраций высвобождение гистамина из тучных клеток и базофилов.

Физиологическая активность описываемого соединения подтверждается рядом испытаний, которые описаны в примерах 1-3.

Пример 1. Определение высвобождения гистамина из тучных клеток крыс.

В испытаниях используются беспородные белые крысы-самцы массой 250-300 г.

Тучные клетки (ТК) крыс выделяют из брюшной и грудной полостей центрифугированием на градиенте плотности фикола. Содержание ТК в выделенной взвеси клеток составляло 85-95. В ряд пробирок, содержащих по 2 мл солевого инкубирующего раствора, предварительно вносят испытуемые соединения в различных концентрациях. В контрольные пробирки испытуемые соединения не вносят. Пробирки выдерживают при температуре 37°С в течение 3-х мин, после чего в них вводят по 5 мкл взвеси ТК и инкубирют в течение 20 мин. После инкубации к образцам клеток добавляют стандартный нецитотоксический высвободитель, который вызывает быструю активацию ТК (вещество 48/80), до конечных концентраций: 1мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 0,2 мкг/мл. Реакцию активации ТК останавливают перенесением пробирок на лед, после чего клетки осаждают центрифугированием при 400 g и 4°С в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают в новые пробирки, клетки лизируют добавлением к осадкам 2 мл дистиллированной воды и встряхиванием на миксере Vortex. В надосадочных и осадочных пробах определяют содержание гистамина спектрофлуорометрическим методом.

Результаты исследований, представленные на фиг.1, показывают, что N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевая соль заметно тормозит секрецию гистамина из ТК, вызванную веществом 48/80, а в концентрациях 10-30 мкМ наблюдается 100% тормозящий эффект.

Пример 2. Определение высвобождения гистамина из базофильных лейкоцитов периферической крови человека.

Для исследования использовали кровь больных поллинозом с повышенной чувствительностью к пыльце злаковых трав и деревьев, установленной по предварительно проведенным пробам с аллергеном. Был отобран материал от больных в возрасте от 15 до 34 лет со средней и тяжелой степенью проявления поллиноза в виде ринита, конъюктивита и бронхиальной астмы.

Из крови обследуемых больных по известной методике (Гущин И.С., Лесков В.П., Читаева В.Г., Полсачева О.В., ж. Иммунология, 1982, №4, с.67-71) получали взвесь мононуклеарных клеток, содержащих 2-4% базофилов и готовили пробы с исследуемым соединением в концентрациях 10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ. Аллергены (пыльцу трав, деревьев или домашнюю пыль) применяли в диапазоне концентраций от 0,1 до 10,0 PNU/ml.

В качестве контрольных использовали образцы без добавления испытуемого соединения.

Приготовленные образцы инкубировали в течение 40 мин при Т=37°С, после чего вносили аллерген и продолжали инкубацию клеток в тех же условиях еще 40 мин. Высвобождение гистамина определяли микроспектрофлуориметрическим методом в осадочных порциях без предварительной экстракции и выражали в процентах к общему содержанию гистамина в порции клеток.

Обнаружено, что соединение согласно описываемому изобретению подавляет активацию клеток-мишеней человека - базофилов.

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что исследуемое соединение в зависимости от концентрации оказывает четкий угнетающий эффект.

Пример 3. Изучение пассивной кожной анафилаксии (ПКА).

Исследования проводили на беспородных крысах-самцах массой тела 210-240 г.

Реакцию ПКА воспроизводили описанным в примере 2 методом.

Исследуемое соединение предварительно разводили в количестве 100 мг в 10 мл физиологического раствора и вводили животным внутрибрюшинно в дозе 100 мг на 1 кг массы тела за 30 мин до внутривенной инъекции разрешающей дозы антигена (овальбумина). В качестве контрольных использовали животных без предварительного введения испытываемых соединений. Результаты оценивали по пороговой кожной реакции, видимой на внутренней стороне кожи. За пороговую реакцию принимали то наибольшее разведение (титр) антиовальбуминовой сыворотки крови, при котором еще возникало прокрашивание кожи.

Графики, представленные на фиг.2, иллюстрируют снижение титра реакции ПКА при ее воспроизведении на крысах, получивших ДЦК.

Таким образом, описываемое соединение обладает противоаллергической активностью и может быть использовано при разработке новых препаратов для фармакологического контроля аллергической реакции, т.е. для создания противоаллергических средств.

Изобретение относится к области медицины, в частности создания фар-макологических препаратов с антиаллергическим действием. Предложено новое вещество с противоаллергическим действием. В качестве такового используют N,N-диэтилдитиокарбаминовую кислоту натриевой соли, ранее известную как радиопротектор. Она относится к группе соединений, обладающих противоаллергической активностью за счет торможения функции клеток-мишеней аллергии, и позволяет повысить эффективность фармакологического контроля аллергических воспалений. 1 табл., 2 ил.

Применение N,N-диэтилдитиокарбаминовой кислоты натриевой соли в качестве вещества, обладающего противоаллергическим действием.