СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА НА ОСНОВЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА АРАЛИЕВЫХ Российский патент 2004 года по МПК C12N5/04 A61K35/78 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, косметической и пищевой промышленности.

Известно, что биомасса культивируемых клеток аралиевых содержит биологически активные вещества (БАВ).

Известны способы получения БАВ путем их извлечения. Различные технологические приемы и режимы оказывают существенное влияние на содержание и соотношение извлекаемых из растительного сырья компонентов, а также на их фармакологическую активность [Муравьев И.А. Технология лекарств: В 2 т. 3-е изд. М.: Медицина, 1980].

Вместе с тем известно, что основные преимущества растительных продуктов определяются совокупным воздействием на организм комплекса веществ клетки в целом.

Для фармакологии и практической медицины актуальна задача увеличения активности лекарственных средств как вновь создаваемых, так и уже применяемых в практике. С увеличением числа хронических заболеваний, требующих длительного приема лекарств и зачастую сопровождающихся различными нарушениями обмена веществ в организме, представляет интерес расширение ассортимента препаратов мягкого воздействия за счет получения модифицированных растительных комплексов. Частичное превращение веществ нативного комплекса уже известных растений может вести к появлению новых синергических эффектов в его фармакологической активности или к увеличению биодоступности комплекса [Лесиовская Е.Е., Пивоварова А.С., Фролова Н.Ю., Марченко Н.В., Дрожжина Е.В. Исследование взаимодействия растений-адаптогенов // V Международный съезд “Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения”: Сб. реф. - СПб., 2001. С.242-246].

Известен с указанием присущей ему фармакологической активности корень женьшеня, разрешенный к медицинскому применению и пригодный к хранению. Его высушивают при температуре не выше 60°С и называют “белый” женьшень [Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. -М.: Медицина, 1990. С.348-349].

Разрешен к медицинскому применению корейский “красный” женьшень, цвет снаружи и на изломе красновато-бурый. Способ получения его не приведен, состав БАВ комплекса не конкретизирован и отличие его активности от таковой "белого" корня не обозначено [Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. -М.: Медицина, 1990. С.349].

В последнее время за рубежом появляются данные о широком терапевтическом (антиканцерогенном, иммунотропном и др.) действии “красного” корня женьшеня [H.Hasegava, R.Suzuki, J.-H.Sung, K.-S. Lee, S.Matsumiya, S.-K.Lee and M.Uchiyama. Antimetastatic Activity of Ginseng saponin intestinal bacterial Metabolite (IH901) // International Ginseng Conference'99 "Ginseng: Its Sciences and its Markets. Advances in Biotechnology, Medicinal Applications @ Marketing": Programme @ Abstracts. P.30; A.Kumagai. Recent Advances of Korean Red Ginseng studies in Japan // Proceeding of the 6th International Symposium. Seoul Korea, 1993. P.14; Y.O.Shin, Y.K,Cho, M.K.Ki, J.S.Lee, J.G.Nam, M.H.Choi, Y.B.Kim, K.W.Choi. Effect of Korean Red Ginseng on immunological Markers of Persons with Human Immunodeficiency Virus // Proceeding of the 6th International Symposium. Seoul Korea, 1993. P.52]. Найдено, в частности, что “красный” женьшень показывает в 7 раз более высокий антиоксидантный эффект и в 30 раз более сильное сосудорасширяющее действие, чем у обычного “белого” корня [Jeong Hill Park, Jong Moon Kirn, Sang Beom Han, Na Young Kim. A new processed Ginseng with Fortified Activity // The 7th International Symposium on Ginseng: Program @ Abstract. Seoul Korea, 1998. P.42].

Известен способ получения “алого” корня женьшеня, когда сырой корень помещают в герметичный мешок, нагревают до 60-100°С для размягчения, затем замораживают, распаковывают в атмосфере инертного газа и лиофильно высушивают [Заявка 62-5406 Японии, МКИ А 61 К 35/78, аналог: Пат. 4446130 США, МКИ 35/78. Способ получения высушенного женьшеня для лекарственного препарата // ИСМ. 1985. А 61 К. №2 (II)].

Известен способ получения “алого” женьшеня путем периодического разбрызгивания горячей воды или погружения корня в горячую воду [Заявка 59-38931 Японии, МКИ А 61 К 35/78. Способ получения “алого женьшеня” // ИСМ. 1985. А 61 К. №9]. При этих способах БАВ остаются в составе целого корня.

Вышеуказанные процессы получения "красного-алого" женьшеня многооперационны, длительны во времени (не менее 12 часов). Они предусматривают использование сырого корня, что приводит к необходимости сопряжения моментов обработки корня и сбора сырья.

Известна биомасса женьшеня сухая, она высушена при температуре не выше 55°С, имеет цвет от светло-желтого до светло-коричневого, влажность не более 8%, содержание суммы гликозидов не менее 1,5%, обладает адаптогенными (в т.ч. антиоксидантной и антигипоксической активностью) и сорбционными свойствами [ВФС 42-1891-89 / Минздрав СССР. Фармакопейный комитет; Пат. 2058784 РФ, МПК А 61 К 35/78. Адсорбирующее средство].

Наиболее близким к предлагаемому является способ, когда сырую биомассу культивируемых клеток для увеличения выхода гликозидов подвергают механическому разрушению и тепловой обработке в автоклаве при температуре 115°С в течение 15 мин. После чего жидкую фракцию отделяют, концентрируют, высушивают, получая до 1,2% сухого водорастворимого порошка с содержанием гликозидов 7,08% [Пат. РФ 2039817, МПК С 12 N 5/04. Способ получения биологически активных веществ из биомассы культивируемых клеток растений].

Существенным недостатком способа является использование сырой биомассы, что неразрывно связывает процесс с циклом культивирования. Шрот биомассы, который составляет до 20% от исходного сырья, остается неиспользованным. Общий состав полученных биологически активных веществ не описан, его активность не охарактеризована. Конечный продукт имеет увеличенное содержание гликозидов, однако известно, что помимо гликозидов ткани аралиевых содержат и ряд других БАВ [Hiromichi Okuda, Yinan Zheng, Yukinaga Matsuura, Takeshi Takaku. Studies on biologically active substances in non-saponin fraction of Korean Red ginseng // Proceeding of the 6th International Symposium. Seoul Korea, 1993. P.110-112].

Задача изобретения - простым технологическим приемом получить в составе сырья культивируемых клеток растений семейства аралиевых (в т.ч. в составе шрота, остающегося после извлечения комплекса БАВ из воздушно-сухой биомассы), активный комплекс, обладающий усиленной адаптогенной активностью, расширить ассортимент таких средств. При этом в задачу изобретения входит также сохранение сорбционных качеств биомассы, достижение взаимной независимости во времени цикла культивирования и моментов получения активированного комплекса в составе сырья или извлечения из него БАВ, а также получения продуктов как с активированной биомассой, так и с извлекаемыми БАВ.

Задача решается следующим образом.

Воздушно-сухую биомассу культуры клеток аралиевых, высушенную при температуре не выше 60°С непосредственно перед обработкой или сухую в стадии хранения, подвергают дополнительной термообработке. В результате этого биомасса приобретает характерный красновато-коричневый оттенок (“красная” биомасса). Температура процесса изменяется в пределах 60 - 150°С, предпочтительно от 100 до 135°С, время составляет 15-90 мин. Полученный активный комплекс биомассы в целом имеет более высокую, чем у исходной адаптогенную (в т.ч. антиоксидантную и антигипоксическую) активность и сохраняет качества сорбента. Взаимонезависимость во времени цикла культивирования биомассы, момента активирования комплекса и получения продуктов на его основе достигается тем, что предварительно высушенная до воздушно-сухой биомасса и ее активация возможны в любое время, а влажность биомассы до и после дополнительной термообработки соответствует необходимой для хранения.

Приведенной закономерности подчиняется как биомасса культуры клеток семейства аралиевых различных штаммов, так и ее шрот, являющийся отходом традиционных технологий при получении настоек из воздушно-сухой биомассы типа “Биоженьшень, настойка” [ВФС 42-1890-89 / Минздрав СССР. Фармакопейный комитет].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Воздушно-сухую биомассу культуры клеток растений семейства аралиевых различных штаммов или ее шрот подвергают дополнительной термообработке при температуре 60-150°С в течение 15-90 мин.

Биомасса приобретает характерный оттенок (Наработан опыт визуального определения момента достижения оптимальных результатов процесса, происходящего в рамках заявленной формулы. Оригинальный опыт является собственностью заявителя, содержит принадлежащее ему ноу-хау и не является предметом данной заявки).

Результаты представлены в табл.1.

Пример 2.

Около 1.0 г (точная навеска) измельченной биомассы, просеянной сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 200-250 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной, закрывают пробкой и оставляют на 1 час. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают, поддерживая слабое кипение в течение 2 часов. После охлаждения колбу с содержимым тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 150-200 мл.

25 мл фильтрата пипеткой переносят в предварительно высушенную при температуре 100-105°С чашку диаметром 7-9 см и выпаривают на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушат при температуре 100-105°С до постоянной массы, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе над безводным хлоридом кальция и взвешивают, рассчитывая процентное содержание экстрактивных веществ [Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.1: Общие методы анализа. - М.: Медицина, 1987. С.295].

Количество экстрактивных веществ, извлекаемых 40-70% этиловым спиртом, определяют по аналогичной схеме, при которой вода очищенная заменяется спиртом соответствующей концентрации.

Результаты представлены в табл.2.

Пример 3.

Измельченную биомассу, просеянную сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, подвергают последовательной экстракции различными растворителями.

Навеску около 5,0 г (точная навеска) заворачивают в патрон из фильтровальной бумаги, помещают в аппарат Сокслета и в течение 3 часов экстрагируют петролейным эфиром. Петролейный эфир сливают в предварительно высушенную и взвешенную круглодонную колбу, отгоняют растворитель и взвешивают колбу с остатком, определяя массу петролейного экстракта (%).

Оставшуюся после экстракции петролейным эфиром навеску заливают хлороформом. Через 3 часа хлороформную фракцию сливают в предварительно взвешенную круглодонную колбу и отгоняют под вакуумом на роторном испарителе досуха, определяя массу хлороформного экстракта (%).

Оставшуюся навеску в течение 6 часов экстрагируют смесью 1:2 спирта этилового с хлороформом (V/V), экстрагент сливают в предварительно взвешенную колбу и отгоняют под вакуумом на роторном испарителе, определяя массу суммарной гликозидной фракции (СГФ, %).

Навеску извлекают из аппарата Сокслета, высушивают на воздухе, взвешивают с точностью до 0,001 г, переносят в коническую колбу вместимостью 200-250 мл, приливают 100 мл воды очищенной, присоединяют обратный холодильник и 30 мин кипятят на песчаной бане. Затем извлечение декантируют в мерную колбу вместимостью 250 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 55 мм. Экстракцию повторяют еще 3 раза по 30 мин, приливая по 100 мл воды каждый раз. Фильтр промывают водой над мерной колбой, содержимое колбы доводят до метки (раствор А).

25 мл раствора А помещают в центрифужные пробирки вместимостью 150 мл, прибавляют 25 мл 95% спирта, перемешивая подогревают на водяной бане при 30°С в течение 5 мин. Пробирки охлаждают, их содержимое центрифугируют в течение 30 мин с частотой 5000 об/мин.

Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПа через высушенный до постоянной массы стеклянный фильтр ПОР016 диаметром 40 мм. Осадок количественно переносят на тот же фильтр с помощью 10 мл смеси воды и 95% спирта (1:1) и промывают 10 мл 95% спирта (ацетона). Фильтр с осадком высушивают на воздухе, доводят до постоянной массы при температуре 102-105°С и взвешивают.

Содержание водорастворимых полисахаридов (ВРП) вычисляют по приведенной в ГФ формуле [Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. - М.: Медицина, 1987. С.379].

Методами традиционной технологии [Муравьев И.А. Технология лекарств: В 2 т. 3-е изд. - М.: Медицина, 1980] получены настои, настойки, экстракты на основе активированной биомассы. Определен качественный и количественный состав БАВ: водо-, водоспирторастворимых веществ, гликозидов (СГФ), водорастворимых полисахаридов (ВРП), а также липофильных веществ до и после дополнительной термообработки.

Сравнительные результаты приведены в табл.2.

Проведенный анализ показывает, что количественное содержание веществ, извлекаемых водой или (40-70) % водоспиртовыми растворами, в “красной” биомассе выше в 1,5-2,0 раза. Содержание гликозидной фракции во всех образцах больше в 2,5-3,0 раза, содержание водорастворимых полисахаридов (ВРП) увеличено в 3 раза, в них в 2 раза больше водорастворимых белков. Количество липофильных веществ выше в 1,5-2,0 раза.

Для оценки фармакологической активности полученного комплекса как комплексный показатель адаптогенных качеств были исследованы сравнительные антигипоксическая и антиоксидантная активности комплексов “красной” и “белой” биомассы разных штаммов аралиевых.

Проведена оценка острой гипобарической гипоксии настоек (1:10; 1:15; 1:20), полученных методом перколяции на 40% спирте этиловом [Муравьев И.А. Технология лекарств: В 2 т. 3-е изд. - М.: Медицина, 1980. - Т.3. С.175]. Препарат вводили внутрибрюшинно, через 30 мин проводили подъем мышей в барокамере со скоростью 50 м/с. на высоту 11 км. Экспозиция на критической высоте - 20 мин. Оценку проводили по проценту выживших животных на данной высоте (табл.3).

Представленные данные свидетельствуют о том, что не только время жизни животных на критической высоте (11 км) при гипобарической гипоксии было увеличено в 3-4 раза по сравнению с контролем, но и процент выживших животных составил от 30 до 50%, что говорит о повышенной антиоксидантной активности всех исследованных препаратов.

Для оценки фармакологической активности было проведено также сравнительное исследование антигипоксической активности ВРП из комплексов “красной” и “белой” биомассы разных штаммов аралиевых (табл.4).

Полученные данные во всех случаях свидетельствуют, что не только время жизни на критической высоте (11 км) животных, получавших ВРП из “красной” биомассы, было в 2-2,5 раза выше, но и процент таких животных в 4 раза был выше, чем у получавших ВРП из “белой” биомассы.

Все сказанное может служить основанием для получения целевых продуктов, в которых как эффективный компонент может быть использован активный комплекс “красной” биомассы клеток культуры ткани растений семейства аралиевых или извлечения из него.

Исследования в данном направлении продолжаются.

Экспериментально установлено, что заявляемые параметры способа, получаемые при его реализации биоактивного комплекса и продуктов на его основе, являются оптимальными с позиций сочетания простоты и достигаемого результата.

Таким образом, предложен технологичный способ получения активного комплекса “красной” биомассы на основе культивируемых клеток растений семейства аралиевых путем дополнительной термообработки воздушно-сухой биомассы. Термообработка сухого сырья осуществлена в одну простую, занимающую до 1,5 часов времени стадию. Способ позволяет получать не только извлекаемые растворителями БАВ и продукты на их основе, но и биоактивный комплекс в составе самой биомассы. Последнее не менее важно, поскольку в состав многих БАД и лекарственных композиций входит само сырье или его шрот, имеющие помимо фармакологической и сорбционную активность. Достигнута взаимная независимость во времени цикла культивирования биомассы, моментов получения активного комплекса и продуктов на его основе.

Полученные заявленным способом комплекс, извлечения и их продукты могут быть использованы для удовлетворения жизненных потребностей человека по крайней мере в соответствии с традиционным назначением биомассы аралиевых.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, косметической и пищевой промышленности. Способ заключается в том, что воздушно сухую биомассу культуры клеток растений семейства аралиевых подвергают дополнительной термообработке при температуре 60-150°С в течение 15-90 мин. Способ предусматривает взаимную независимость во времени цикла культивирования биомассы, момента получения активного комплекса и, в случае необходимости, продуктов на его основе. Полученный активный комплекс имеет большую, чем у исходного, адаптогенную активность и сохраняет качества сорбента. Сам комплекс, извлечения из него и продукты на их основе могут быть использованы для удовлетворения жизненных потребностей человека в соответствии с традиционным назначением биомассы аралиевых. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения активного комплекса в составе сырья на основе культивируемых клеток растений семейства аралиевых, обладающего усиленным адаптогенным действием и сорбционной способностью, предусматривающий использование в качестве исходного сырья воздушно-сухой биомассы, ее дополнительную термообработку при температуре 60-150°С в течение 15-90 мин.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительную термообработку предпочтительно проводят при температуре 100-135°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют извлечение комплекса растворимых биологически активных веществ в сроки, определенные для хранения полученного активного комплекса в составе сырья.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что извлечение комплекса растворимых биологически активных веществ (вес.% от биомассы) осуществляют до получения: экстрактивных веществ, извлекаемых водой, - 30-60, в т.ч. ВРП - от 8,0 до 20,0, и/или экстрактивных веществ, извлекаемых 40-70% водно-спиртовыми растворами, - 26,0-57,0, и/или суммы гликозидов - от 6,0 до 10,5, и/или липофильных веществ от 0,1 до 2.