СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ЖЕНЬШЕНЯ Российский патент 1999 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, к способам получения биомассы растительных клеток, а именно штаммам женьшеня, которые могут быть использованы в медицине, косметике и/или пищевой промышленности.

Известен способ получения биологически активных веществ (БАВ) женьшеня путем культивирования клеток женьшеня на стандартной питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы, углеводы, стимуляторы роста и др. [1]. В процессе культивирования по данному способу клетки накапливают гликозиды женьшеня.

Также известен способ получения БАВ из культуры растительных клеток, при котором каллусную ткань, например, родиолы розовой первоначально культивируют на одной питательной среде, а затем пересаживают на измененную питательную среду и растят на ней до заложения меристем корневых апексов [2]. Этот способ позволяет повысить выход биомассы и целевого продукта. Недостатком способа является его большая трудоемкость за счет двухэтапного культивирования и как следствие необходимость дополнительного приготовления новой питательной среды и дополнительные затраты. В итоге получают те же продукты, что и в нативном корне.

Также известен способ, при котором на каллусную культуру тканей женьшеня длительно воздействуют экзогенными фитогормонами, в результате их оптимального сочетания наблюдается повышение до 4-5% суммы гликозидов и расширяется их спектр [3] . Однако недостатком этого способа является то, что даже при длительном воздействии экзогенными фитогормонами синтеза новых веществ не происходит и биомасса содержит только гликозиды женьшеня.

Наиболее близким к предложенному способу является способ, при котором в питательную среду вносят некоторые метаболиты - предшественники синтеза гликозидов женьшеня [5]. При этом установлено, что данные вещества (мевалоновая кислота, фарнезол или сквален) в зависимости от их дозы могут ингибировать или стимулировать как рост биомассы, так и синтез гликозидов. Новых продуктов при этом также не образуется.

Задача изобретения - разработать простой и технологичный способ получения биомассы, содержащей комплекс БАВ женьшеня с новыми продуктами метаболизма, обеспечивающими расширение фармакологического спектра действия.

Известно, что в ряде случаев совместное использование нескольких видов растений расширяет спектр и усиливает эффект их совместного фармакологического действия. Обычно для этого используют целый ряд готовых лекарственных средств, в состав которых входят настойки из нескольких лекарственных растений, например, настойка ландыша и настойка валерианы или настойка ландыша и настойка боярышника [4]. При этом используются БАВ, которые синтезируются в ходе метаболизма in vivo только в данных видах лекарственных растений.

Поставленная задача реализуется путем культивирования штаммов женьшеня на твердой питательной среде, в которую дополнительно вносят концентрат или концентраты, лекарственных растений из различных семейств.

Способ осуществляется следующим образом.

Примеры 1.1. -1.3. приведены для способов с использованием концентратов из растений семейства Betulaceae, например Betula pubescens Ehrh.

Пример 1.1. Готовят 1 л стандартной питательной среды [1] для культивирования штамма женьшеня, например ИФРЖ-5 и добавляют к ней 20 мл/л концентрата из листьев березы (B. pubescens Ehrh) (концентраты получены в соответствии с рекомендациями на соответствующее лекарственное сырье - ГФ-XI, т. 2, c. 147). Полученную питательную среду разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,8-1 атм. На стерильной питательной среде культивируют биомассу при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток. В конце цикла культивирования биомассу снимают и сушат при температуре 50-55^oC.

Количество биомассы по данному способу на 30 сутки составляет 520,0 г/л по сырой массе, содержание экстрактивных веществ больше по сравнению с контролем на 13,05%, сумма гликозидов составляет 3,87% (см. табл. 1).

В полученной биомассе наряду с гликозидами женьшеня, характерными для исходного штамма, содержатся флавоновые гликозиды, свойственные листьям березы (см. табл. 2).

Примеры 1.2. и 1.3. приведены для получения биомассы путем культивирования штаммов женьшеня ИФРЖ-5 по способу, описанному в примере 1.1., но с измененным объемом концентрата листьев березы. По этим примерам отмечено повышение выхода биомассы на 31,25 и 29,00%, суммы гликозидов на 1,12-1,03%, экстрактивных веществ на 27 и 17% соответственно. Установлено появление нового класса соединений - фенольных гликозидов, характерных для сем. Betulaceae. Результаты отражены в табл. 1.

Примеры 2.1. - 2.3. приведены для способов с использованием концентрата из растений сем. Asteraceae, например Calendula officinalis L.

Пример 2.1. Готовят 1 л стандартной питательной среды [1] для культивирования штамма женьшеня ИФРЖ-5 и добавляют к ней 15 мл/л концентрата из цветков календулы (Calendula officinalis L.). Питательную среду, полученную таким образом, разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,8-1 атм. На стерильной питательной среде культивируют биомассу при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток. В конце цикла культивирования биомассу снимают, сушат при температуре 50-55^oC. По предложенному способу в биомассе увеличено содержание суммы гликозидов на 1,17%, экстрактивных веществ на 14%, накопление биомасссы коррелировало с контролем. Биомасса содержит наряду с гликозидами женьшеня флавоновые гликозиды, свойственные цветкам календулы (см. табл. 1, 2).

Примеры 2.2. , 2.3. приведены для получения биомассы путем культивирования штаммов женьшеня ИФРЖ-6 по способу, описанному в примере 2.1., но с измененным объемом концентрата цветков календулы в питательной среде. В полученной биомассе также установлено наличие гликозидов женьшеня и флавоновых гликозидов, характерных для цветков календулы. Отмечено незначительное понижение продуктивности биомассы и увеличение содержания экстрактивных веществ на 14%.

Примеры 3.1 и 3.3. приведены для способов с использованием концентратов из растений семейства Fagaceae, например Quercus robur L.

Пример 3.1. Готовят 1 л стандартной питательной среды [1] для культивирования штамма женьшеня ИФРЖ-5 и добавляют к ней 10 мл/л концентрата из коры дуба (Quercus robur L.). Полученную питательную среду разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,8-1 атм. На стерильной питательной среде культивируют биомассу штамма женьшеня при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток. В конце цикла культивирования биомассу снимают и сушат при температуре 50-55^oC. По данному способу выявлено повышение накопления количества биомассы на 11,5%, а экстрактивных веществ на 13% (см. табл. 1). Дубильных веществ не обнаружено.

Примеры 3.2. , 3.3. приведены для получения биомассы путем культивирования штаммов женьшеня ИФРЖ-5 по способу, описанному в примере 3.1., но с измененным объемом концентрата коры дуба в питательной среде. Продуктивность биомассы снизилась на 35 и 76%, а содержание экстрактивных веществ повышено на 18 и 17% соответственно (см. табл. 1). Дубильные вещества не обнаружены.

Примеры 4.1. - 4.3. приведены для способов с использованием концентрации из растений семейства Fabaceae, например Glycyrrhiza glabra L.

Пример 4.1. Готовят 1 л стандартной питательной среды [1] для культивирования штамма женьшеня ИФРЖ-10 и добавляют к полученной питательной среде 25 мл/л концентрата из корня солодки (Glycyrrhisa glabra L.). Полученную питательную среду разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,8-1 атм. На стерильной питательной среде культивируют биомассу при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток. В конце цикла культивирования биомассу снимают, сушат при температуре 50-55^oC. При этом отмечено повышение продуктивности биомассы на 14%, суммы гликозидов на 4%, а также повышение содержание экстрактивных веществ на 15%. Отмечено расширение спектра гликозидов и появление новых фенолкарбоновых кислот, свойственных корню солодки (см. табл. 1.2).

Примеры 4.2.,4.3. приведены для получения биомассы путем культивирования штаммов женьшеня ИФРЖ-10 по способу, описанному в примере 4.1., но с измененным объемом концентрата корня солодки. В биомассе, полученной по данному способу, наряду с гликозидами, характерными женьшеню, отмечено наличие тритерпеновых сапонинов и фенолкарбоновых кислот, свойственных солодке. Продуктивность штамма снижена, но наряду с этим отмечено повышение содержания экстрактивных веществ на 24% (см. табл. 1, 2).

Примеры 5.1-5.3. приведены для способов с использованием концентратов из растений семейства Parmeliaceae, например Cetraria islandica Ach.

Пример 5.1. Готовят 1 л стандартной питательной среды [1] для культивирования штамма женьшеня, например ИФРЖ-6, и добавляют к ней 15 мл/л концентрата из слоевища лишайника (Cetraria islandica Ach). Полученную питательную среду разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,88-1 атм. На стерильной питательной среде культивируют биомассу при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток. В конце срока культивирования биомассу снимают и сушат при температуре 50-55^oC.

Количество биомассы по данному способу на 30-e сутки составляет 423,6 г/л по сырой массе, содержание экстрактивных веществ по сравнению с контролем на 15,54% выше, сумма гликозидов составляет 4,04% (см. табл. 1).

В полученной биомассе наряду с гликозидами женьшеня, характерными для исходного штамма, содержатся лишайниковые кислоты (см. табл. 2).

Примеры 5.2. и 5.3. приведены для получения биомассы путем культивирования штаммов женьшеня ИФРЖ-6 по способу, описанному в примере 5.1., но с измененным объемом концентрата слоевища лишайника. По примеру 5.2. отмечено повышение выхода биомассы на 7,6% и содержания экстрактивных веществ на 15,01%. Продуктивность штамма, полученного по способу, описанному в примере 6.3. , снизилась на 32,45%, но наряду с этим отмечено повышение содержания экстрактивных веществ на 15,84%.

Примеры 6.1. -6.3. приведены для способов с использованием сочетания концентратов растений из различных семейств, например Betula pubescens Ehrh. , Quereus robur L., Glycyrrhisa glabra L.

Пример 6.1. Готовят 1 л стандартной питательной среды для культивирования ИФРЖ-5 и добавляют к ней 5 мл/л концентрата из листьев березы, корня солодки и коры дуба. Полученную питательную среду разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,8-1 атм. На стерильной питательной среде культивируют биомассу штамма женьшеня при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток. В конце цикла культивирования биомассу снимают, сушат при температуре 50-55^oC. В полученной биомассе наряду с гликозидами женьшеня, характерными для исходного штамма, содержатся флавоновые гликозиды, тритерпеновые сапонины, фенолкарбоновые кислоты, характерные для листьев березы и корня солодки. Наблюдается увеличение продуктивности биомассы на 25%, содержание экстрактивных веществ на 28% (см. табл. 1, 2).

Примеры 6.2., 6.3. приведены для способов получения биомассы путем культивирования штамма женьшеня ИФРЖ-5 по описанному способу в примере 6.1., но с измененным объемом концентратов в питательной среде. Эти способы позволяют повысить продуктивность биомассы на 32%, содержание экстрактивных веществ на 30%, отмечено наличие новых классов соединений, свойственных растениям, из которых получены концентраты. Результаты отражены в табл. 1, 2.

Контроль. Готовят 1 л стандартной питательной среды для культивирования штамма женьшеня, например ИФРЖ-1, содержащий макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахарозу 2%, агар-агар 0,6%, кинетин 1 мг/л, α-нафтилуксусную кислоту (НУК) 2 мг/л и др. [1]. Полученную питательную среду разливают по сосудам емкостью 200-250 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,8-1 атм. На стерильную питательную среду производят засев биомассы и культивируют ее при температуре 25±1^oC, в темноте, в течение 30 суток.

На этой среде накопление биомассы на 30 суток составляет 400 г/л по сырой массе, содержание экстрактивных веществ до 38% и суммы гликозидов до 1,5%.

Данный способ не обеспечивает синтеза новых продуктов метаболизма.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить принципиально новые продукты метаболизма, не свойственные штамму женьшеня, путем культивирования клеток на питательной среде, дополнительно содержащей концентрат или концентраты, полученные из разных органов природного растительного сырья от растений различных семейств (см. табл. 2). Использованы лекарственные растения, разрешенные к применению, при этом получен комплекс БАВ, содержащий новые продукты метаболизма, которые не только усиливают адаптогенный эффект, характерный для гликозидов женьшеня, но также расширяют спектр иммуномодулирующего, противовоспалительного, антимикробного и другого действия за счет присутствия известных БАВ, свойственных этим растениям.

Источники информации
1. Писецкая Н.Ф. К вопросу о подборе питательной среды для культуры ткани женьшеня // Раст. ресурсы. - 1970. - N 6. - Вып. 4. - С. 516-522.

2. А. с. 885252 СССР /Александрова И.В., Данилина А.Н., Галкина Л.В., Анисимов О. Л. // Способ получения биологически активных веществ. - 1981. - Бюл. N 44.

3. Губарь С.И., Гулько Т.П., Кунах В.А. Рост и накопление гликозидов в каллусной культуре тканей женьшеня при длительном культивировании экзогенных фитогормонов // Физиол. раст. - 1997. - Т. 44. - N 1. - С. 97 - 103.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. - М.: Медицина, 1993. - Ч. 1. 736 с., Ч. 2. 688 с.

5. Ходаковская М.В., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Влияния некоторых метаболитов изопреноидного пути на накопление биомассы и содержание гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня. // Биотехнология, 1997, N 1, с. 42-47.

Изобретение относится к биотехнологии. Полученная биомасса может быть использована в медицине, косметике и/или пищевой промышленности. Культивируют клетки штамма женьшеня на твердой питательной среде, содержащей источник метаболитов, не свойственных женьшеню. В качестве источника метаболитов используют концентрат или концентраты из лекарственных растений различных семейств, например, Betulaceae, Asteraceae, Fagaceae, Fabaceae, Parmeliaceae. Это способствует обогащению биомассы комплексом биологически активных веществ, свойственных исходному штамму, а также новыми биологически активными веществами. 2 табл.

Способ получения биомассы женьшеня, включающий культивирование штамма женьшеня на твердой питательной среде в присутствии источника метаболитов, отличающийся тем, что в среду вносят концентрат или концентраты из лекарственных растений в качестве источника метаболитов, не свойственных женьшеню.