УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БЕЛКА Российский патент 2004 года по МПК A23J3/00 C30B7/00 C30B7/14 C30B29/58 C30B30/08 

Предпосылки изобретения

1. Область техники

Настоящее изобретение относится к устройству и способу, предназначенным для кристаллизации белка.

2. Известный уровень техники

Технология выращивания кристалла белка является важной при структурном анализе белка. Структура кристалла белка может быть идентифицирована путем использования такого способа анализа как дифракция рентгеновских лучей. Идентификация структуры кристалла белка является необходимой, в особенности при разработке лекарственных препаратов, включающих кристаллы белка.

Известен способ кристаллизации белка в неподвижных условиях (способ групповой обработки в неподвижных условиях, способ диффузии жидкость-жидкость (свободная граница) и способ диализа небольшого количества, и так далее). В способе кристаллизации белка путем снижения растворимости белка раствор белка и буферный раствор, содержащий осаждающий реактив, помещают в один сосуд. Когда осаждающий реактив диффундирует в раствор белка, растворимость белка снижается, и белок кристаллизуется.

Однако при обычном способе кристаллизации белка путем снижения растворимости белка в неподвижных условиях трудно обеспечить изотропный рост кристалла белка.

Более того, кристаллизация белка проходит медленно, что сказывается на скорости роста кристалла. По этой причине требуется длительное время для выращивания кристалла белка. Это является фактором, затрудняющим улучшение структурного анализа белка.

В соответствии с вышеприведенным описанием известен способ кристаллизации белка, описанный в выложенной заявке на японский патент (JP-A-Heisei 6-321700). При обычном способе кристаллизации белка гель 105 белка, содержащий белок, осаждающий гель 106, содержащий осаждающий реактив, и гель 107 буферного раствора, содержащий только буферный раствор, помещают в сосуд 101, как показано на фиг.1. При этом при обычном способе кристаллизации для подачи материала белка, необходимого для роста кристалла белка, используется гель. В вышеуказанном документе описано, что гели используются для того, чтобы свести к минимуму конвекцию. В сосуде 101 формируется многослойная структура, в которой осаждающий гель 106, гель 107 буферного раствора, гель 105 белка, гель 107 буферного раствора и осаждающий гель 106 расположены последовательно слоями друг над другом. Сосуд 101 переворачивают вверх и вниз по мере роста кристалла белка. При таком обычном способе кристаллизации белка осаждающий реактив, содержащийся в осаждающем геле 106, проходит через гель 107 буферного раствора и диффундирует в гель 105 белка. В настоящем изобретении не требуется применять желатинизацию, и в нем используется технология, существенно отличающаяся от обычного способа кристаллизации белка.

Краткое описание изобретения

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание способа кристаллизации белка, который позволял бы обеспечить более изотропный рост кристалла белка и с помощью которого стало бы возможным ускорить рост кристалла белка, а также создать устройство для осуществления такого способа.

Устройство кристаллизации белка включает секцию держателя сосуда и блок вращения. Сосуд закреплен с возможностью отсоединения в секции держателя сосуда. Блок вращения вращает секцию держателя сосуда вокруг первой и второй осей вращения. Сосуд содержит раствор белка, и кристалл белка растет в ходе вращения секции держателя сосуда.

Блок вращения может включать первый узел вращения, который вращает сосуд вокруг первой оси вращения, и второй узел вращения, который вращает первый узел вращения вокруг второй оси вращения. В данном случае первый узел вращения может включать внутреннюю рамку, на которой установлена секция держателя сосуда, и первый двигатель, который вращает внутреннюю рамку. Кроме того, второй узел вращения может включать внешнюю рамку, на которой установлен первый узел вращения, и второй двигатель, который вращает первый узел вращения.

Блок вращения вращает секцию держателя сосуда так, чтобы удовлетворялись следующие дифференциальные уравнения (1):

где ϕ представляет угол между заранее определенным направлением, перпендикулярным первой оси вращения, и внешней рамкой, и θ - это угол между заранее определенным направлением, перпендикулярным второй оси вращения, и внутренней рамкой, и А и В выбирают таким образом, чтобы отношение 2m/n (где m и n положительные целые числа) не было равно целому числу для минимальных значений n и m, удовлетворяющих соотношению А:В=n:m.

Кроме того, предпочтительно, чтобы блок вращения вращал секцию держателя сосуда так, чтобы сила тяжести воздействовала на сосуд изотропно.

Кроме того, сосуд может содержать основной корпус, имеющий отверстие; крышку, герметично закрывающую отверстие корпуса; впитывающий элемент, который установлен в секции сосуда и который пропитан раствором осаждающего реактива; и заглушку, расположенную в секции сосуда на некотором расстоянии от впитывающего элемента, предназначенную для содержания в ней раствора белка. Осаждающий реактив испаряется из впитывающего элемента и диффундирует вовнутрь секции сосуда. Осаждающий реактив впитывается раствором белка, и происходит осаждение кристалла белка.

В другом аспекте настоящего изобретения способ кристаллизации белка выполняется путем (а) установки сосуда в секцию держателя сосуда; (b) вращения секции держателя сосуда вокруг первой и второй осей вращения; и (с) выращивания кристалла белка в ходе вращения секции держателя сосуда; при котором в сосуде содержится раствор белка.

Этап (b) вращения может быть обеспечен благодаря вращению сосуда вокруг первой оси вращения и вращению первого блока вращения вокруг второй оси вращения.

Кроме того, этап (b) вращения может быть обеспечен путем вращения секции держателя сосуда так, чтобы удовлетворялись следующие дифференциальные уравнения (1):

где ϕ - это угол поворота по отношению к первой оси вращения, и θ - это угол поворота по отношению ко второй оси вращения, а А и В выбираются таким образом, чтобы отношение 2m/n (где m и n представляют собой положительные целые числа) не было равно целому числу для минимальных значений n и m, удовлетворяющих соотношению А:В=n:m.

Кроме того, этап (b) вращения может быть обеспечен путем вращения секции держателя сосуда таким образом, чтобы сила тяжести воздействовала на сосуд изотропно.

Кроме того, способ кристаллизации белка может дополнительно включать использование сосуда. Сосуд включает секцию сосуда, содержащую отверстие; закупоривающую секцию, которая закрывает отверстие секции сосуда; впитывающий элемент, который установлен в секции сосуда и который пропитан раствором осаждающего реактива; и заглушку, расположенную на некотором расстоянии от впитывающего элемента в секции сосуда, предназначенную для содержания раствора белка. Осаждающий реактив испаряется из впитывающего элемента и диффундирует внутрь секции сосуда. Этап (d) выращивания может быть обеспечен путем испарения осаждающего реактива из впитывающего элемента; поглощения осаждающего реактива раствором белка и осаждения кристалла белка.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует известный способ кристаллизации белка;

фиг.2 изображает устройство кристаллизации белка в соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения;

фиг.3А и 3В - конструкция сосуда;

фиг.4А - фотография наблюдения за поверхностью кристалла лизоцима, который был выращен при условии вращения сосуда, фиг.4В - фотография наблюдения за поверхностью кристалла лизоцима, который был выращен в условиях отсутствия вращения сосуда.

Описание предпочтительных вариантов воплощения

Ниже будет подробно описано устройство кристаллизации белка в соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения со ссылками на прилагаемые чертежи.

На фиг.2 изображено устройство кристаллизации белка в соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения.

Устройство кристаллизации белка содержит трехмерный клиностат 1 и сосуд 2. Кристалл белка выращивают в сосуде 2.

Трехмерный клиностат 1 содержит основной блок 3, двигатель 4, внешнюю рамку 5, двигатель 6, внутреннюю рамку 7 и секцию 8 держателя сосуда. Основной блок 3 содержит основание 3а и ножки 3b и 3с. Ножки 3b и 3с скреплены с основанием 3а. Двигатель 4 установлен на ножке 3b. Внешняя рамка 5 соединена с двигателем 4, двигатель 4 имеет ось 4а вращения и вращает внешнюю рамку 5. Двигатель 6 установлен на внешней рамке 5. Внутренняя рамка 7 соединена с двигателем 6. Двигатель 6 имеет ось 6а вращения и вращает внутреннюю рамку 7. Ось 6а вращения, по существу, расположена перпендикулярно оси 4а вращения.

Секция 8 держателя сосуда соединена с внутренней рамкой 7. Секция 8 держателя сосуда вращается одновременно с внутренней рамкой 7. На секции 8 держателя сосуда закреплен вышеуказанный сосуд 2. Когда внешняя рамка 5 и внутренняя рамка 7 вращаются, соответственно сосуд вращается так, что он имеет две оси вращения. При этом сосуд 2 расположен вблизи точки пересечения оси 4а вращения с осью 6а вращения.

На фигурах 3А и 3В изображена конструкция сосуда 2. Фиг.3А изображает вид сосуда 2 в сечении по вертикали. Фиг.3В изображает поперечное сечение сосуда 2 вдоль линии А-А’, представленной на фигуре 3А. Сосуд 2 содержит основной корпус 21 сосуда, заглушку 22 и крышку 23.

Как показано на фигуре 3А, на верхней поверхности заглушки 22 сформирована выемка 22а. Небольшое количество раствора белка, в котором растворен белок, помещают в выемку 22а. Количество раствора белка обычно составляет приблизительно 20 мкл. Используется раствор белка, обладающий текучестью. Раствор белка, помещенный в выемку 22а, удерживается в выемке 22а благодаря силе поверхностного натяжения. Таким образом, даже если сосуд 2 вращается, раствор белка никогда не выливается из выемки 22а. Таким образом, существенно упрощается механизм удержания раствора белка. Кроме того, как показано на фигуре 3В, в заглушке 22 сформированы выемки 22b, которые проходят через заглушку 22 от верхней поверхности заглушки 22 до ее нижней поверхности.

Внутри основного корпуса 21 сосуда помещена целлюлозная волокнистая масса 24. Целлюлозная волокнистая масса 24 пропитана раствором, в котором растворен осаждающий реактив. Небольшое количество осаждающего реактива, которым пропитана целлюлозная волокнистая масса 24, испаряется через выемки 22b и диффундирует в раствор белка, помещенный в выемку 22а. Когда осаждающий реактив диффундирует в раствор белка, растворимость белка снижается, и белок кристаллизуется из раствора белка.

Целлюлозная волокнистая масса 24 удерживает раствор осаждающего реактива так, что раствор осаждающего реактива никогда не вытекает из нее при вращении сосуда 2. Это предотвращает контакт раствора осаждающего реактива с раствором белка, который помещен в выемку 22а, при вращении сосуда 2.

Основной корпус 21 сосуда содержит отверстие 21а. Раствор белка и раствор осаждающего реактива помещают в сосуд 2 через это отверстие 21а. Крышка 23 закрывает отверстие 21а так, что внутренний объем сосуда 2 герметично закрыт.

Далее будет описана процедура выращивания кристалла белка.

Вначале в сосуд 2 помещают раствор белка и раствор осаждающего реактива.

Раствор белка помещают в вышеуказанную выемку 22а. При этом целлюлозная волокнистая масса 24 пропитана раствором осаждающего реактива. Затем отверстие 21а герметично закрывают с помощью крышки 23. Далее сосуд 2 устанавливают в секцию 8 держателя сосуда.

После этого внешнюю рамку 5 и внутреннюю рамку 7 приводят во вращение двигателем 4 и двигателем 6 соответственно. Сосуд 2 вращается при этом вокруг двух осей вращения. При вращении сосуда 2 осаждающий реактив испаряется внутри сосуда 2. Испарившийся осаждающий реактив диффундирует в раствор белка, помещенный в выемку 22а, через выемки 22b, сформированные в заглушке 22. Когда осаждающий реактив диффундирует в раствор белка, растворимость белка в растворе белка снижается, и белок кристаллизуется. При этом, поскольку сосуд 2 вращается, в ходе кристаллизации белка обеспечивается изотропный рост кристалла белка.

Необходимо рассмотреть два следующих условия, обеспечивающих изотропный рост кристалла белка при вращении сосуда 2. Первое условие состоит в том, что предполагается, что при вращении раствор белка находится в спокойном движении так, что обеспечивается равномерная концентрация белка. Для обеспечения изотропного роста кристалла белка необходимо, чтобы концентрация белка в растворе белка была равномерной. При вращении сосуда 2 раствор белка находится в спокойном движении так, что обеспечивается равномерная концентрация белка. Таким образом, предполагается, что обеспечивается изотропный рост кристалла белка. Второе условие состоит в том, что при вращении выращиваемый кристалл белка никогда не оседает на дно сосуда, в котором содержится раствор белка, и никогда не прикрепляется к его стенкам. Если кристалл белка осядет в сосуде или прикрепится к стенке, произойдет нарушение роста кристаллов на поверхности соприкосновения. Таким образом, при этом невозможно будет обеспечить изотропный рост кристалла. Предполагается, что вращение сосуда 2 предотвращает оседание кристалла белка и прикрепление его к стенке, что позволяет обеспечить изотропный рост кристалла белка.

Кроме того, при вращении сосуда 2 получают кристалл белка более крупных размеров. Причина этого не совсем понятна. Однако считается, что только часть центров кристаллизации кристалла белка растет избирательно, и центры кристаллизации срастаются в большой кристалл белка, когда сосуд 2 вращается.

Предпочтительно, чтобы двигатель 4 и двигатель 6 соответственно вращали внешнюю рамку 5 и внутреннюю рамку 7 таким образом, чтобы сила тяжести воздействовала на сосуд 2 изотропно. То есть, когда сосуд 2 наблюдают в течение достаточно длительного времени, желательно, чтобы сила тяжести воздействовала равномерно на сосуд 2 во всех направлениях. Это позволяет обеспечить более изотропный рост кристалла белка.

Предпочтительно, чтобы двигатель 4 и двигатель 6 соответственно вращали внешнюю рамку 5 и внутреннюю рамку 7, как описано ниже. Предполагается, что ϕ представляет собой угол между произвольным направлением, перпендикулярным оси 4а вращения, и внешней рамкой 5. Кроме того, предполагается, что θ - это угол между произвольным направлением, перпендикулярным оси 6а вращения, и внутренней рамкой 5. При этом внешняя рамка 5 и внутренняя рамка 7 вращаются таким образом, что углы ϕ и θ удовлетворяют следующим дифференциальным уравнениям:

,

Следует отметить, что исходные значения ϕ и θ выбирают произвольно. Кроме того, А и В выбирают таким образом, чтобы отношение 2m/n не было равно целому числу для минимальных значений n и m, удовлетворяющих соотношению А:В=n:m.

Когда углы ϕ и θ установлены так, что удовлетворяются дифференциальные уравнения (1), сила тяжести изотропно воздействует на сосуд 2. Причина этого описана в выложенной заявке на японский патент (JP P2000-79900A), которая подана правопреемником настоящего изобретения.

В соответствии с этим ниже представлен конкретный пример выращивания кристалла белка с помощью устройства кристаллизации белка по данному варианту воплощения.

Буферный раствор, растворяющий лизоцим, в котором растворили лизоцим, использовали в качестве раствора белка. Концентрация лизоцима в буферном растворе, растворяющем лизоцим, составила 80 мг/мл. Уксусную кислоту и уксуснокислый натрий растворили в буферном растворе, растворяющем лизоцим, в качестве буферного вещества. Значения концентраций уксусной кислоты и уксуснокислого натрия составляли 50 мМ соответственно. Буферный раствор, растворяющий лизоцим, приготовили с уровнем рН 4,7.

Буферный раствор, растворяющий хлористый натрий, в котором растворили хлористый натрий, использовали как раствор осаждающего реактива. Концентрация хлористого натрия составила 1,0 М. Уксусную кислоту и уксуснокислый натрий растворили в буферном растворе, растворяющем хлористый натрий, в качестве буферных агентов. Значения концентраций уксусной кислоты и уксуснокислого натрия составили 50 мМ соответственно. Буферный раствор, растворяющий хлористый натрий, приготовили с уровнем рН 4,7.

Буферный раствор, растворяющий лизоцим, поместили в выемку 22а заглушки 22 в количестве 20 мкл. Кроме того, буферным раствором, растворяющим хлористый натрий, пропитали целлюлозную волокнистую массу 24 в количестве 300 мкл. Сосуд 2 герметично закрыли с помощью крышки 23 и установили в секции 8 держателя сосуда.

Трехмерный клиностат 1 включили в работу, и начался рост кристалла лизоцима. Внешняя рамка 5 вращалась со средней скоростью вращения приблизительно 1,5 об/мин вокруг оси вращения 4а. Внутренняя рамка 7 вращалась со средней скоростью вращения приблизительно 1,7 об/мин вокруг оси вращения 6а. Таким образом, сосуд 2 вращался вокруг двух осей вращения так, что на него изотропно воздействовала сила тяжести. В ходе вращения сосуда 2 поддерживали его постоянную температуру на уровне приблизительно 20°С. Вращение продолжали в течение 90 часов. После этого полученный кристалл лизоцима извлекли из сосуда.

Для сравнения был проведен аналогичный эксперимент в условиях отсутствия вращения сосуда 2.

Анализ структуры кристалла, такой как измерение размера кристалла, наблюдение внешнего вида, измерение плотности и дифракция рентгеновских лучей, выполняли на полученном кристалле лизоцима.

На основании наблюдений за внешним видом было обнаружено, что более изотропный кристалл лизоцима был получен при вращении сосуда 2. На фиг.4А изображена фотография наблюдения за поверхностью кристалла лизоцима, который был выращен в условиях вращения сосуда 2. На фиг.4В изображена фотография наблюдения за поверхностью кристалла лизоцима, который был выращен в условиях отсутствия вращения сосуда 2. Кристалл лизоцима, который был выращен в условиях вращения сосуда 2, имел более гладкую поверхность. Это показывает, что при вращении сосуда 2 обеспечивается более изотропный рост кристалла лизоцима.

Кроме того, в результате измерений размера кристалла было обнаружено, что наличие или отсутствие вращения сосуда 2 влияет на размер кристалла лизоцима. В условиях вращения сосуда 2 были получены кристаллы лизоцима, имеющие размер больше 200 мкм, и кристаллы лизоцима, имеющие размер меньше 20 мкм. С другой стороны, кристаллы лизоцима с размерами в диапазоне от 50 мкм до 100 мкм, были получены при условиях отсутствия вращения сосуда 2. Это показывает, что только часть центров кристаллизации кристаллов лизоцима растет избирательно, и что центры кристаллизации вырастают в большой кристалл лизоцима, когда сосуд 2 вращается.

В результате измерения плотности и анализа структуры кристалла было обнаружено, что наличие или отсутствие вращения сосуда 2 не влияет на плотность кристалла лизоцима, структуру кристаллической решетки и кристаллит. В таблице представлены характеристики полученных кристаллов лизоцима.

Плотность кристалла лизоцима составила приблизительно 1,25 г/мл независимо от наличия или отсутствия вращения сосуда 2. Результат рентгеновского анализа показал, что полученные кристаллы лизоцима имели тетрагональную кристаллическую структуру и принадлежали к точечной группе Р4₃2₁2 независимо от наличия или отсутствия вращения сосуда 2. Кроме того, в результате рентгеновского анализа размеры элементарных ячеек были приблизительно равны друг другу, независимо от наличия или отсутствия вращения сосуда 2. Кроме того, в результате наблюдения мозаичной диффузии было обнаружено, что индекс мозаики составил 0,2 и был равен в обоих случаях. Кроме того, полученный кристалл лизоцима облучали рентгеновскими лучами для получения брэгговского отражения. При этом было обнаружено, что максимальные разрешающие способности всех кристаллов лизоцима были приблизительно равны 1,4 или превышали эту величину и приблизительно были равны друг другу. Таким образом, было показано, что вращение сосуда 2 не имело отрицательного влияния на кристаллит полученного кристалла лизоцима.

Настоящее изобретение раскрывает способ кристаллизации белка, который способствует росту кристалла белка.

Кроме того, настоящее изобретение раскрывает способ кристаллизации белка, который позволяет выращивать более изотропный кристалл белка.

Изобретение относится к устройству и способу, предназначенным для кристаллизации белка. Устройство состоит из секции держателя сосуда и блока вращения. Сосуд закреплен с возможностью отсоединения в секции держателя сосуда. Блок вращения вращает секцию держателя сосуда вокруг первой и второй осей вращения. Сосуд состоит из корпуса сосуда, имеющего отверстие, закупоривающей крышки, которая герметично закрывает указанное отверстие корпуса сосуда, впитывающий элемент, который установлен в секции сосуда и пропитан раствором осаждающего реактива, и заглушку, установленную на некотором расстоянии от впитывающего элемента, предназначенную для содержания раствора белка. Осаждающий реактив испаряется и диффундирует внутрь секции сосуда при вращении секции держателя сосуда. Осаждающий реактив впитывается раствором белка, и происходит осаждение кристалла белка. Изобретение позволяет обеспечить более изотропный рост кристалла белка и ускорить рост кристалла белка, а также создать устройство для осуществления такого способа. 2 с. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Устройство кристаллизации белка, содержащее секцию (8) держателя сосуда, в которой закреплен с возможностью отсоединения, по меньшей мере, один сосуд (2) и блок (1) вращения секции (8) держателя сосуда вокруг первой и второй осей (4а, 6а), вращения, в котором указанный сосуд (2) содержит раствор белка, и кристалл белка растет в ходе вращения указанной секции держателя сосуда.2. Устройство кристаллизации белка по п.1, отличающееся тем, что блок вращения содержит первый узел вращения сосуда вокруг первой оси вращения и второй узел вращения первого узла вращения вокруг второй оси вращения.3. Устройство кристаллизации белка по п.2, отличающееся тем, что первый узел вращения содержит внутреннюю рамку (7), на которой закреплена секция держателя сосуда, и первый двигатель (6), приспособленный для вращения внутренней рамки, второй узел вращения содержит внешнюю рамку (5), на которой установлен первый узел вращения, и второй двигатель (4), приспособленный для вращения первого узла вращения.4. Устройство кристаллизации белка по п.3, отличающееся тем, что блок вращения выполнен с возможностью вращения секции держателя сосуда так, что удовлетворяются дифференциальные уравнения

где ϕ - угол между заранее определенным направлением, перпендикулярным к первой оси вращения, и внешней рамкой;

θ - угол между заранее определенным направлением, перпендикулярным второй оси вращения, и внутренней рамкой;

при этом А и В выбраны таким образом, что отношение 2m/n, где m и n положительные целые числа, не равно целому числу для минимальных n и m, удовлетворяющих соотношению А:В=n:m.

где ϕ - угол поворота по отношению к первой оси вращения;

θ - угол поворота по отношению ко второй оси вращения;

А и В выбирают таким образом, чтобы отношение 2m/n, где m и n положительные целые числа, не было равно целому числу для минимальных значений n и m, удовлетворяющих соотношению А:В=n:m.