КОМБИНАЦИИ НА ОСНОВЕ НЕТРОПСИНА ИЛИ ЕГО БИС-ПРОИЗВОДНОГО, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2004 года по МПК A61K31/40 A61K31/522 A61K31/662 A61K31/7076 A61P31/22 

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и касается разработки и создания новых комбинаций, обеспечивающих высокоэффективное ингибирование инфекции, вызываемой вирусом герпеса простого типа 1, на основе использования двух классов соединений, обладающих принципиально различным механизмом подавления герпесвирусной инфекции - с одной стороны, производных нетропсина и, с другой стороны, модифицированных нуклеозидов или фосфоноуксусной кислоты.

Противовирусная активность и механизм действия противоопухолевых антибиотиков нетропсина и дистамицина хорошо известны. Они связываются в узкой бороздке ДНК в области связывания транскрипционных факторов с сайтами, состоящими из 4-5 пар АТ-оснований соответственно, ингибируя инициацию транскрипции [1, 2]. Они также ингибируют активность ДНК-топоизомераз I и II [3, 4], обратной транскриптазы и интегразы вируса иммунодефицита человека [5]. Однако эти антибиотики не нашли применения в клинической практике из-за высокой токсичности.

Одним из путей повышения селективности (избирательности) связывания этих соединений с ДНК является синтез бис-производных нетропсина и дистамицина, ковалентно связанных друг с другом в различных ориентациях. Начиная с 80-х годов, известная группа Е. DeClercq с соавторами изучала активность бис-производных нетропсина, соединенных алифатической цепочкой, состоящей из 0-10 метиленовых звеньев, в ориентации хвост-к-хвосту [6] и производных нетропсина, содержащих дополнительные пиррольные циклы [7]. Было установлено, что эта группа соединений обладает противоопухолевой активностью, способна селективно ингибировать репродукцию вируса вакцины (химиотерапевтический индекс (ХТИ) до 500). Была обнаружена невысокая активность этих соединений в отношении вируса герпеса простого типа 2 (ХТИ 6 и ниже). В отношении вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) активность практически отсутствовала. В ряде случаев минимальная цитотоксическая концентрация была снижена в 5-10 раз по сравнению с нетропсином.

В доступной нам литературе данных об изучении противовирусной активности комбинации нетропсина и дистамицина или их производных с модифицированными нуклеозидами или аналогами пирофосфата обнаружено не было.

Нами был синтезирован ряд бис-производных нетропсина, оказавшихся высокоселективными ингибиторами репродукции ВПГ-1 [8]. Была проверена их способность усиливать противогерпетическую активность известных лекарственных препаратов, что могло позволить также снизить токсический эффект благодаря снижению активных концентраций.

Сущность изобретения заключается в создании двухкомпонентных комбинаций на основе нетропсина или его бис-производного с модифицированными нуклеозидами или фосфоноуксусной кислотой, обеспечивающих значительное усиление противогерпетического действия по сравнению с каждым из комбинируемых противовирусных соединений, взятых в отдельности, и приводящих к увеличению избирательности противогерпетического действия.

При изучении противогерпетической активности соединений и их комбинаций in vitro культуру клеток Vero инфицировали ВПГ-1 штамм L₂ с множественностью 0,1 БОЕ/кл (где БОЕ - бляшкообразующая единица) и инкубировали под жидкой средой поддержки, содержащей препараты или их комбинации в известных концетрациях. После 48 часов инкубации, когда в контроле вируса развивался 95-100% цитопатический эффект, определяли концентрации, на 50% ингибирующие развитие вирусиндуцированного цитопатического эффекта по сравнению с контролем - ИД₅₀. Эффект комбинации соединений оценивали путем вычисления индекса FIC (fractional inhibitory concentration) как сумму отношений ИД₅₀ каждого из комбинируемых соединений в комбинации к ИД₅₀ соединения при использовании отдельно. При величине FIC <0,5 эффект комбинации оценивался как выраженный синергидный, при FIC <0,9 как синергидный, при FIC = 1,0 как аддитивный, при FIC >1,0 индифферентный или антагонизм.

Пример 1. Изучение биологической активности комбинации нетропсина с модифицированными нуклеозидами и фосфоноуксусной кислотой на модели ВПГ-1 в культуре клеток.

Комбинация нетропсина с ацикловиром, ганцикловиром, Ара-А и фосфоноуксусной кислотой приводит к усилению противогерпетического эффекта. 50%-ное ингибирование вирусиндуцированного цитопатического эффекта достигается при сочетанном применении нетропсина (фиг.1) в неэффективной концентрации 2,5 мкг/мл (1/2 ИД₅₀) и ацикловира, ганцикловира, видарабина(Ара-А) и фосфоноуксусной кислоты, также взятыми в неэффетивных концентрациях, в 5, 5, 2 и 4 раза меньших, чем ИД₅₀ этих соединений, взятых в отдельности. Соответствующие данные приведены в таблице. Полученный эффект можно оценить как синергидный (FIC <0,9 для комбинации нетропсина с ацикловиром, ганцикловиром и фосфоноуксусной кислотой) или аддитивный (FIC = 1,0 для комбинации с видарабином (Ара-А).

Пример 2. Изучение биологической активности комбинации бис-нетропсина 1 с модифицированными нуклеозидами и фосфоноуксусной кислотой на модели ВПГ-1 в культуре клеток.

При сочетанном применении бис-нетропсина 1 (фиг.2) и ацикловира на 50% ингибировать развитие вирусиндуцированного цитопатического эффекта удается при их использовании в концентрациях в 33 и 6 раз меньших, чем ИД₅₀ при монотерапии. При использовании бис-нетропсина 1 в комбинации с ганцикловиром их концентрации удается снизить в 16 и 5 раз соответственно (выраженный синергидный эффект). При комбинации бис-нетропсина-1 с фосфоноуксусной кислотой отмечен синергидный эффект. При использовании бис-нетропсина 1 в комбинации с видарабином (Ара-А) 50% ингибирование вирусиндуцированного цитопатического эффекта достигается при сочетанном применении этих соединений в концентрациях, равных 1/2 ЦД₅₀ (аддитивный эффект).

Пример 3. Изучение цитотоксического действия нетропсина, бис-нетропсина 1 и их комбинаций in vitro.

В таблице представлены результаты изучения токсического действия нетропсина и бис-нетропсина 1, а также их комбинаций в культуре клеток Vero с использованием метода окрашивания клеток трипановым голубым, основанным на способности мертвых клеток окрашиваться красителем. После 72-часовой инкубации клеток в присутствии изучаемых соединений или их комбинаций клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра и определяли величину ЦД₅₀ - концентрацию соединений, в присутствии которых погибает не более 50% клеток по сравнению с контролем, инкубируемым без препаратов. Как видно из таблицы, предлагаемые комбинации малотоксичны: при их использовании в диапазоне концентраций, обеспечивающих активное подавление герпесвирусной инфекции, величина ЦД₅₀ не достигается.

Таким образом комбинация нетропсина, бис-нетропсинов с модифицированными нуклеозидами или фосфоноуксусной кислотой обеспечивает ингибирующее аддитивное и синергидное действие на модели ВПГ-1 в культуре клеток.

В основе усиления противогерпетического эффекта комбинаций бис-нетропсинов и модифицированных нуклеозидов лежит различный механизм их действия на синтез вирусной ДНК. Нетропсин и бис-нетропсины специфически связываются в узкой бороздке ДНК с кластерами из нескольких АТ-пар оснований, препятствуя таким образом связыванию белков, участвующих в регуляции процессов транскрипции или репликации ДНК. Модифицированные нуклеозиды, являясь аналогами природных нуклеозидов в виде трифосфатов, включаются в состав синтезируемой цепочки вирусной ДНК, приводя к терминации синтеза ДНК, ингибируют активность ДНК-полимеразы. Фосфоноуксусная кислота конкурирует с обменом пирофосфата из дезоксинуклеозидтрифосфата, связываясь с ДНК-полимеразой, ингибирует ДНК-полимеразу. Положительный эффект изобретения заключается в создании комбинаций соединений (бис-нетропсинов с модифицированными нуклеозидами или фосфоноуксусной кислотой), обеспечивающих значительное усиление противогерпетического действия по сравнению с каждым из комбинируемых противовирусных веществ, взятых в отдельности.

Литература

1. Dervan P.B., Burli R.W. // Current Opinion in Chem. Biol., 1999, V.3, P. 688-693.

2. Korka M.L., Yoon D., Goodsell D et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985. V.82. P. 1376-1380.

3. Beerman T.A., Woynarowski J.M., Sigmund R.D. et al. // Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1090. P. 52-60.

4. Burkhardt G., Simon H., Storl К et al. // J. Biomol. Struct. Dyn., 1997. V.15. P. 81-95.

5. Filipowsky M.E., Kopka M.L., Brazil-Zison M. et al. // Biochemistry, 1996. V.35. P. 15397-15410.

6. Lown J.W., Krowicki K., Balzarini J. et al. // J. Med. Chem., 1989. V.32. P. 2368-2375.

7. Baraldi P.O., Balboni G., Pavani M.G. et al. // J.Med.Chem., 2001. V.44. P. 2536-2543.

8. Андронова В.Л., Гроховский С.Л., Суровая А.Н. и др. // ДАН, 2001. Т.380, №4. С. 1-4.

Изобретение относится к медицине, а именно к разработке новых комбинаций антигерпетического действия. Предложена комбинация, состоящая из нетропсина и ацикловира, или ганцикловира, или фосфоноуксусной кислоты, или видарабина (Ара-А). Предложена также комбинация бис-производного нетропсина (фиг.2) и фосфоноуксусной кислоты, или видарабина (Ара-А). Комбинации обеспечивают высокий уровень противовирусной активности в отношении вируса герпеса. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Комбинация, обладающая антигерпетической активностью, состоящая из нетропсина и ацикловира, или ганцикловира, или фосфоноуксусной кислоты, или видарабина (Ара-А).2. Комбинация, обладающая антигерпетической активностью, состоящая из бис-производного нетропсина

и фосфоноуксусной кислоты или видарабина (Ара-А).