ФОСФОНАТНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ АЦИКЛОВИРА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК C07F9/141 C07F9/40 A61K31/661 A61K31/662 A61P31/22 

Изобретение относится к новым биологически активным фосфонатным производным 9-[(2-гидроксиэтилокси)метил]гуанина, (ацикловир, АЦВ), способу их получения и фармацевтическим композициям на основе этих соединений, которые могут найти применение в медицине.

Предлагаемые соединения обладают противовирусным действием, в первую очередь против вируса герпеса простого, тип 1 (ВПГ-1).

Известно, что ингибировать репродукцию ВПГ можно на разных стадиях его жизненного цикла, но очевидно, что наиболее целесообразно использовать ингибиторы биосинтеза ДНК вируса герпеса. ДНК-полимераза вируса герпеса является ключевым ферментом в цикле репликации вируса и, соответственно, является наиболее привлекательной мишенью для подавления размножения вируса. В настоящее время основную группу лекарств, используемых для лечения ВПГ, представляют нуклеозидные аналоги - предшественники ингибиторов ДНК-полимеразы вируса герпеса. К ним относятся в первую очередь ациклические нуклеозидные аналоги: АЦВ, валацикловир (валиновый эфир ацикловира), а также ганцикловир, пенцикловир и фамцикловир.

Ранее был запатентован фосфит АЦВ (А.с. 1594953 СССР, 1990), как соединение, демонстрирующее существенную противогерпетическую активность на штамме, резистентном к действию АЦВ.

Однако его действие недостаточно выражено, что может быть связано с его анионной природой.

Сущность изобретения заключается в получении новых неионных фосфорсодержащих производных АЦВ в качестве соединений, высокоселективно подавляющих репродукцию ВПГ-1 и эффективных против штаммов, резистентных к действию АЦВ, с целью их применения в противовирусных фармацевтических композициях.

В соответствии с настоящим изобретением предлагаются неионогенные эфиры фосфита и алкоксикарбонилфосфоната АЦВ (формула I и II):

где R' и R''=алкил, арил или аралкил

Эти фосфонатные эфиры представляют собой не заряженные соединения, способные эффективно проникать через клеточные мембраны и выступать в качестве депо-формы АЦВ с пролонгированным действием.

Механизм превращения соединений формулы I и II в активную форму внутри клетки на сегодняшний день не ясен. Основной предполагаемый механизм заключается в том, что происходит прямое или постадийное химическое или ферментативное отщепление фосфонатной группы с образованием АЦВ и его последующим фосфорилированием до трифосфата. Эти соединения могут быть актуальны для химиотерапии герпетических инфекций и могут быть использованы в качестве лекарственных средств. Для получения фармацевтических композиций на основе соединений формул I и II возможно применение различных вспомогательных средств (наполнителей) органической или неорганической природы, которые используют в процессе производства готовых лекарственных форм для придания им необходимых свойств. Содержание композиций в таких лекарственных формах может составлять до 80% массы. Эти фармацевтические композиции могут быть приготовлены по известным технологиям.

Для получения соединений формулы I и II может быть использован следующий синтетический подход:

где R' и R''=Alk-, Ar-, Ar-(CH₂)_n-

Он заключается в конденсации АЦВ с фосфористой или алкоксикарбонил-фосфоновыми кислотами с последующей этерификацией заряженных фосфонатов III и IV соответствующим спиртом. Получающиеся соединения формул I и II могут быть выделены и очищены рутинными способами, например, осаждением, хроматографией и т.д.

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами.

Пример 1. Синтез Р-(изо-пропилового эфира) фосфита ацикловира (I, R"=iPr) и его выделение.

К охлажденному до 0°С раствору фосфита АЦВ (III) (71 мг, 0.23 ммоль) в смеси 5 мл пиридина и 0.5 мл изо-пропанола прибавляли PivCl (100 мкл, 0.8 ммоль), выдерживали 18 ч при 5°С. Разбавляли реакционную массу 10 мл воды, упаривали в вакууме, соупаривали с водой (3×5 мл), остаток растворяли в 2 мл воды и наносили на колонку (2×18 см) с LiChroprep RP-8 (Merck, 25-40 мкм), элюировали в линейном градиенте МеОН в воде (0→20%, V 0.5 л). Фракции, содержащие фосфонат I, упаривали, перерастворяли в воде и лиофильно высушивали. Выход 43 мг (56%). ¹H-NMR (DMSO-d₆, δ, ppm, J, Hz): 10.62с (1H, NH), 7.82с (1Н, H-8), 6.79д (1H, J_H,P 698, H-P), 6.51с (1H, NH₂), 5.37с (2Н, CH₂Gua), 4.55 м (1H, CH-iPr), 4.05 м (2H, СН₂OР). 3.66т (2H, J 4.4, СН₂ОС), 1.23 т (6Н, J_{СН3, СН} 6.2, СН₃-iPr). ³¹P-NMR (DMSO-d₆): 8.16 ддг (¹J_H,P 698, ³JP, CH₂ ~ ³J_{Р, СН} 9.2). UV (метанол): λ_max 254 нм.

Пример 2. Синтез Р-(изо-пропилового эфира) этоксикарбонилфосфоната ацикловира (II, R'=Et, R''=iPr,) и его выделение.

К охлажденному до 5°C раствору этоксикарбонилфосфоната АЦВ (IV, R'=Et) (76 мг, 0.2 ммоль) в смеси 5 мл пиридина и 0.5 мл изопропанола прибавляли при перемешивании двумя порциями с интервалом в 3 ч 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид (120 мг, 0.4 ммоль), затем выдерживали 18 ч при 5°С. Разбавляли реакционную массу 10 мл воды, упаривали в вакууме, соупаривали с водой (3×5 мл), остаток растворяли в 3 мл воды и наносили на колонку (2×18 см) с LiChroprep RP-8, элюировали в линейном градиенте МеОН в воде (0→30%, V 0.5 л). Фракции, содержащие фосфонат II, упаривали, переупаривали с этанолом, растворяли в смеси хлороформа и метанола (95:5), и наносили на колонку (2.5×25 см) с силикагелем, продукт элюировали системой хлороформ - метанол (9:1). Растворители упаривали в вакууме, остаток растворяли в воде и лиофильно высушивали. Выход 43 мг (56%). ¹H-NMR (CD₃OD): 7.87с (1H, Н-8), 5.49с (2H, CH₂Gua), 4.79 м (1H, CH-iPr), 4.31 м (4Н, СН₂ОР, СН₂-Et), 3.83 дд (2H,.J 3.7, 4.7, СН₂OС), 1.30-1.36 м (9Н, СН₃-iPr. СН₃-Et). ³¹P-NMR (СD₃OD): - 4.87 д (³J_{P, CН2} ~ ³J_{P, CH}7.1).

UV (МеОН): λ_mах 254 нм.

Пример 3. Таблетированная форма.

Для приготовления таблетки используют следующий состав: соединение I (R''=iPr) - 200 мг, кальций карбонат осажденный - 110 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 40 мг, аэросил - 13 мг, кальция стеарат- 12 мг.

Соединение I (R''=iPr) смешивают с аэросилом и микрокристаллической целлюлозой, и добавляют карбонат кальция. Полученную смесь опудривают стеаратом кальция и перемешивают до получения однородной массы. Эту таблеточную смесь прессуют в брикеты на таблеточном прессе. Полученные брикеты измельчают на грануляторе. Гранулы прессуют на таблеточном прессе до получения таблеток массой 375 мг.

Была изучена стабильность синтезированных соединений формулы I и II в водных растворах и в сыворотке крови человека.

Пример 4. Химический гидролиз соединений формулы I и II.

К 10 мМ раствору соединений I и II в воде (5 мкл) добавляют 95 мкл буфера PBS (рН 7.2) (8.0 г NaCl, 0.2 г КН₂PO₄, 0.2 г КСl и 2.16 г Na₂HPO₄ ×7 Н₂О на 1 л воды) и инкубируют при 37°C. Через определенные промежутки времени отбирают аликвоты и исследуют их методом ТСХ и ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ: колонка (4×150 мм) Lichrosorb RP-18 (Merck) (7 мкм); градиент буфера Б в буфере А. Буфер А: 5 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 4.8), буфер Б: - 66% МеОН. 0-5 мин - Буфер А; 5-10 мин 0→10% буфер Б; 10-25 мин 10→25% буфер Б; 25-30 мин 25→80% буфер Б; 30-35 мин 80→100% буфер Б; 35-40 мин 100% буфер Б. Данные приведены в таблице 1.

Пример 5. Гидролиз соединений формулы I и II в сыворотке крови человека.

К 10 мМ раствору соединений I и II в воде (5 мкл) добавляют сыворотку крови человека (100%, 95 мкл) и инкубируют при 37°С. Через определенные промежутки времени к аликвотам (15 мкл) прибавляют МеОН (45 мкл), выдерживают 20 мин при -20°С и центрифугируют. Супернатант упаривают. К остатку прибавляют 10 мкл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 4.8) и анализируют ВЭЖХ в условиях, описанных выше. Результаты приведены в Таблице 1.

Пример 6. Исследование противовирусной активности фосфонатов АЦВ в отношении ВПГ-1.

Культуру клеток Vero (клетки почек африканских зеленых мартышек), поддерживают в среде Игла, содержащей 5% эмбриональной сыворотки телят.

Эталонный штамм вируса герпеса простого BПT-1/L₂ получен из Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Клинический изолят ВПГ-1 резистентный к АЦВ (Авд), получен путем инфицирования культуры клеток Vero вируссодержащим материалом от больных ВПГ-1. В качестве контроля используют АЦВ. Вирусы поддерживают путем пассирования в средах Игла и 199 в соотношении 1:1, с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование клеток и их последующее инфицирование проводят в 96-луночных пластиковых планшетах.

Антивирусное действие оценивают по способности изучаемых соединений ингибировать развитие вирусиндуцированного цитопатогенного действия (ЦПД) на 50% (ID₅₀) и 95% (ID₉₅) по сравнению с ЦПД в контрольных инфицированных культурах. Множественность инфекции составляет 0.1 БОЕ/клетку. Результаты учитывают через 48 ч.

Цитотоксичность соединений количественно определяют по окрашиванию клеток трипановым синим. За величину CD₅₀ принимают ту концентрацию соединения, при которой выживаемость клеток через 72 ч контакта с изучаемыми соединениями составляет 50%. Индекс селективности (IS) вычисляют как отношение CD₅₀ к ID₅₀.

Таким образом, показано, что испытанные соединения формулы I и II обладают способностью ингибировать репродукцию вируса простого герпеса, тип 1 в культуре клеток Vero, причем эффективность этих препаратов превышает эффективность используемого в клинической практике препарата АЦВ (таблица 2) и действуют на штаммы вируса простого герпеса, резистентные к действию АЦВ (таблица 3). Фармацевтические композиции на основе этих соединений могут быть перспективны для создания новых лекарственных средств, необходимых для лечения герпесвирусных инфекций.

Изобретение относится к новым биологически активным фосфонатным производным ацикловира. Описываются фосфонатные производные 9-[(2-гидроксиэтилокси)метил]гуанина (АЦВ) общей формулы:

где R' и R'' представляют собой алкил, арил или аралкил. Также описывается способ получения фосфонатных производных ацикловира. Технический результат - получены новые соединения, обладающие избирательной антигерпетической активностью с эффективностью, превышающей эффективность действия АЦВ, и действующие на штаммы вируса простого герпеса, резистентные к действию АЦВ, кроме того, заявленные соединения могут входить в эффективной терапевтической дозе в качестве действующего вещества в фармацевтическую композицию для использования в виде лекарственного средства, обладающего антигерпетической противовирусной активностью. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Фосфонатные производные 9-[(2-гидроксиэтилокси)метил]гуанина (АЦВ) общей формулы

где R' и R'' представляют собой алкил, арил или аралкил.