ПРОИЗВОДНЫЕ НЕТРОПСИНА, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2010 года по МПК C07K14/00 C07K5/06 A61K38/05 A61K38/16 A61K31/40 A61P31/12 A61P31/22 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается выявления противовирусного действия у производных нетропсина: сарколизин-нетропсина, бис-нетропсина 1 и 15-Лиз-бис-нетропсина.

К настоящему времени, когда уже более 25 лет не проводится вакцинация населения против оспы, дети и большая часть взрослого населения, главным образом моложе 27-30 лет, не имеют иммунитета к вирусу оспы. Поэтому разработка новых препаратов, способных селективно ингибировать репродукцию ортопоксвирусов, является важной задачей, имеющей не только теоретическую, но и практическую направленность. Актуальность проблемы разработки таких препаратов повышает то обстоятельство, что вирус оспы может быть использован в качестве объекта биотерроризма.

Одним из возможных путей воздействия на ортопоксвирусную инфекцию является использование соединений (например, нетропсина, дистамицина), специфически связывающихся с вирусной ДНК и ингибирующих активность ключевых вирусных ДНК-связывающих белков. Механизм действия нетропсина и дистамицина хорошо изучен: связываясь в узкой бороздке ДНК с сайтами из 4-5 пар АТ-оснований, они могут ингибировать инициацию транскрипции и/или репликации [1, 2]. Однако эти соединения не нашли применения в клинической практике из-за высокой токсичности.

С целью усиления селективности (избирательности) их действия, а следовательно, снижения токсичности были синтезированы бис-нетропсины и нетропсин-пептидные конъюгаты, которые избирательно ингибируют инициацию транскрипции с разных промоторов в бактериальных и эукариотических клетках и влияют на активность эукариотических транскрипционных факторов [3-6]. Некоторые из них также ингибируют активность ДНК-топоизомераз I и II [7, 8], обратной транскриптазы и интегразы вируса иммунодефицита человека [9-10].

В группе димерных производных нетропсина и дистамицина (состоящих из двух ковалентно связанных метиленовыми мостиками молекул производных нетропсина) были обнаружены соединения, способные подавлять репродукцию вируса вакцины более эффективно, чем исходные нетропсин и дистамицин [11]. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) наиболее активных из этих соединений в культуре клеток PRK (primary rabbit kidney) колебался от 20 до 500. Однако в культуре клеток Vero селективность этих же соединений оказалась существенно, в 10-30 раз, ниже (а для наиболее активного из них соединения 20а с ХТИ 500 даже в 100 раз ниже), несмотря на то что их токсичность для культуры клеток Vero была меньше в 2-5 раз, чем для PRK. Важно также отметить, что при изучении противовирусной активности производных нетропсина и дистамицина в культуре клеток PRK не было обнаружено корреляции между противогерпесвирусной активностью (модель вируса герпеса простого) и активностью в отношении вируса вакцины. Например, максимальная величина ХТИ на модели вируса герпеса простого типа 1 (штамм KOS) составляла 3 (соединение 18а), а на модели вируса вакцины - 200. Это обстоятельство указывает на специфический характер антивирусного действия этих соединений.

Данные о противовирусной активности синтезированного нами соединения SARC-NT (4-[N,N-бис(2-хлорэтил)амино]-DL-фенилаланин-нетропсин) (фиг.1) и противоортопоксвирусной активности Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT в литературе отсутствуют. Химический синтез SARC-NT представлен в работе [17]. Ранее нами был синтезирован ряд новых производных нетропсина, в том числе Pt-bis-NT (фиг.2) и 15Lys-bis-NT (фиг.3), высокоселективно ингибирующих репродукцию вируса герпеса простого типа 1, включая варианты, устойчивые к действию базовых противогерпетических лекарств. ДНК-связывающая и противогерпетическая активности Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT описаны в работах [12, 13, 16, 18, 19].

Сущность изобретения заключается в выявлении селективного противовирусного действия у производных нетропсина: SARC-NT, Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT. Противовирусное действие на примере противогерпесвирусной и противоортопоксвирусной активности изучена у SARC-NT. Также обнаружен новой эффект у противогерпесвирусных соединений: Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT - противоортопоксвирусная активность. Противогерпесвирусное действие изучено на примере модели вируса герпеса простого типа 1, противоортопоксвирусное действие - на примере модели вируса осповакцины. Эти соединения обеспечивают высокоэффективное ингибирование инфекций, вызываемых вирусами осповакцины и герпеса. SARC-NT селективно подавляет репродукцию вируса осповакцины (химиотерапетический индекс равен 64) и ингибирует в меньшей степени репродукцию вируса герпеса (химиотерапетический индекс равен 8). Обнаружена ярко выраженная ортопоксвирусная активность у производных нетропсина: Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT, которые эффективно ингибируют репродукцию вируса герпеса простого типа 1, включая варианты вируса герпеса, устойчивые к действию базовых противогерпетических лекарств.

Настоящее изобретение в его конкретных признаках станет более очевидным благодаря нижеприведенным примерам. Эти примеры представлены с целью иллюстрации изобретения, но не с целью какого бы то ни было его ограничения.

Пример 1. Биологическая активность SARC-NT, а также Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT.

Изучение противовирусной активности предлагаемых производных нетропсина проводили in vitro в культуре клеток Vero. Для определения противоортопоксвирусной активности клетки инфицировали вирусом осповакцины (вирус вакцины) (дермовакцина, штамм 111). Для определения противогерпесвирусной активности использовали вирус герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) штамм L₂. Штаммы вирусов получены из Государственной коллекции вирусов Государственного учреждения Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской академии медицинских наук.

В качестве референс-препаратов использовали Ара-А (9-β-D-аденинарабинозид, видарабин), "Calbiochem", США; рибавирин (виразол), ICN Pharmaceutical, США.

При изучении противовирусной активности соединений in vitro культуру клеток Vero инфицировали с множественностью 0,1 БОЕ/кл (где БОЕ - бляшкообразующая единица) и инкубировали под жидкой средой поддержки, содержащей соединения в известных концентрациях. Для вируса осповакцины среда поддержки - среда Игла, содержащая 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Для вируса герпеса среда поддержки - среды 199 и Игла, соединенные в соотношении 1:1. После 48 ч инкубации, когда в контроле вируса развивался 95-100% цитопатический эффект (ЦПЭ), определяли концентрации ИД₅₀, ингибирующие развитие вирусиндуцированного ЦПЭ на 50% по сравнению с контролем, и ИД₉₅ - концентрации, практически полностью ингибирующие развитие вирусиндуцированного ЦПЭ.

Пример 2. Изучение цитотоксического действия SARC-NT, a также Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT in vitro

Цитотоксичность препаратов оценивали общепринятым методом окрашивания клеток красителем трипановым голубым, основанным на способности мертвых клеток окрашиваться этим красителем. После 72-часовой инкубации клеток в присутствии изучаемых соединений клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра и определяли величину ЦД₅₀ - концентрацию соединений, в присутствии которых погибает не более 50% клеток по сравнению с контролем, инкубируемым без препаратов.

В таблице (фиг.4) представлены результаты изучения токсического действия нетропсина, SARC-NT, Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT. Как видно из таблицы (фиг.4), SARC-NT, так же как Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT, характеризуется существенно меньшей токсичностью, чем нетропсин, что указывает на селективный характер взаимодействия этих соединений с вирусной ДНК.

Пример 3. Противовирусная активность нетропсина и его производных в отношении вируса вакцины in vitro

SARC-NT, Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT эффективно ингибируют развитие вирусиндуцированного ЦПЭ в культуре клеток Vero, инфицированных вирусом осповакцины (штамм 111). Величины химиотерапевтических индексов (ХТИ), вычисляемых как отношение ЦД₅₀ к ИД₅₀ и характеризующих уровень селективности соединений, равны 59 (15Lys-bis-NT), 64 (SARC-NT), 198 (Pt-bis-NT), тогда как ХТИ нетропсина <3,7. Существенно, что предлагаемые производные нетропсина: SARC-NT, Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT, способны полностью ингибировать развитие вирус-индуцированного ЦПЭ в диапазоне нецитотоксических концентраций. Селективность противовирусного действия этих соединений в отношении вируса осповакцины сравнима или превосходит активность таких известных лекарственных препаратов, как рибавирин или видарабин.

Пример 4. Противогерпетическая активность SARC-NT in vitro

В таблице (фиг.4) приведены результаты изучения противогерпетической активности SARC-NT в культуре клеток Vero. Как видно из данных таблицы (фиг.4), SARC-NT обеспечивает достижение 50% ингибирования развития вирусиндуцированного ЦПЭ при использовании в нецитотоксичной концентрации, равной 1/8 ЦД₅₀. Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT более эффективно подавляют репродукцию вируса герпеса простого 1 типа (химиотерапевтические индексы равны 59 и 47 для Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT соответственно). Селективность противогерпесвирусной активности SARC-NT существенно меньше, чем селективность действия Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT (химиотерапевтический индекс для SARC-NT равен 8).

Предлагаемые производные нетропсина in vitro обладают противовирусным действием. Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT, ранее запатентованные в качестве соединений, обладающих антигерпетической активностью, обеспечивают высокоэффективное ингибирование инфекции, вызываемой вирусом осповакцины. SARC-NT обладает значительной противоортопоксвирусной активностью и умеренным противогерпесвирусным действием. Выявленные различия в активности предлагаемых производных нетропсина при подавлении инфекций, вызываемых вирусами герпеса и осповакцины, коррелируют с ДНК-связывающей активностью этих соединений [16].

Фармацевтические композиции на основе этих соединений могут быть перспективны для создания новых противовирусных средств.

Литература

1. Dervan P.B., Burli. R.W. // Current Opinion in Chem. Biol., 1999, v.3, p. 688-693.

2. Kopka M.L., Yoon D., Goodsell D. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, v.82, p. 1376-1380.

3. Gursky G.V., Zasedatelev A.S., Zhuze A.L. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983, v.47, p. 367-378.

4. Gotesfeld J.M., Turner J.M., Dervan P.D. // Gene Expression, v.9, p. 77-83.

5. Dickinson L.A., Gulizia R.J., Trauger J.W. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v.95, p. 12890-121895.

6. Belikov S.V., Grokhovsky S.L., Isagulians M.V. et al. // J. Biomol. Struct. Dyn., 2005, v.23, p. 193-202.

7. Beerman T.A., Woynarowski J.M., Sigmund R.D. et al. // Biochim. Biophys. Acta, 1991, v.1090, p. 52-60.

8. Burkhardt G., Simon H., Storl K. et al. // J. Biomol. Struct. Dyn., 1997, v.15, p. 81-95.

9. Filipowsky M.E., Kopka M.L., Brazil-Zison M. et al. // Biochemistry, 1996, v.35, p. 15397-15410.

10. Neamati N., Mazumder A., Sinder S. Et al. // Mol. Pharm., 1998, v.54, p. 280-286.

11. Lown J.W., Krowicki K., Balzarini J. et al. // J. Med. Chem., 1989, v.32, p. 2368-2375.

12. Андронова В.Л., Гроховский С.Л., Суровая А.Н. и др. // ДАН, 2001, т. 380, с.548-551.

13. Андронова В.Л., Гроховский С.Л., Суровая А.Н. и др. // ДАН, 2005, т. 400, с.822-826.

14. Андронова В.Л., Гроховский С.Л., Суровая А.Н. и др. // ДАН, 2007, т.413, с.380-384.

15. Baraldi P.O., Balboni G., Pavani M.G. et al. // J.Med.Chem., 2001, v.44, p. 2536-2543.

16. Gursky G., Nikitin A., Surovaya A., Grokhovsky S., Andronova V., Galegov G. In: Nanomaterials for Application in Medicine and Biology, (NATO Workshop, Bonn). Springer, 2008, p. 17-28.

17. Гроховский С.Л., Готтих Б.П., Жузе А.Л. // Биоорган, химия, 1992, т.18, с.570-583.

18. Патент RU 2240792. «Комбинации на основе нетропсина или его бис-производного, обладающие антигерпетической активностью». Галегов Г.А., Андронова В.Л., Гурский Г.В., Суровая А.Н., Гроховский С.Л. Приоритет 30.07.2002 г.

19. Патент RU 2265610. «Димерное производное нетропсина - 15-Лиз-бис-нетропсин - и комбинации на его основе, обладающие антигерпетической активностью». Галегов Г.А., Андронова В.Л., Гурский Г.В., Суровая А.Н., Гроховский С.Л. Приоритет 20.04. 2004 г.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Сущность изобретения заключается в выявлении селективного противовирусного действия у производных нетропсина: SARC-NT, Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT. Изучено противовирусное действие на примере противогерпесвирусной и противоортопоксвирусной активности у SARC-NT. Также обнаружен новой эффект у соединений Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT - противоортопоксвирусная активность. Эти соединения обеспечивают высокоэффективное ингибирование инфекций, вызываемых вирусами осповакцины и герпеса. Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT обеспечивают высокоэффективное ингибирование инфекции, вызываемой вирусом осповакцины. SARC-NT обладает значительной противоортопоксвирусной активностью и умеренным противогерпесвирусным действием. SARC-NT, Pt-bis-NT и 15Lys-bis-NT могут быть перспективны для создания новых противовирусных средств. 2 н.п. ф-лы, 4 ил.

1. Средство, обладающее противоортопоксивирусной активностью, представляющее собой производные нетропсина: сарколизин-нетропсин (4-[N,N-бис(2-хлорэтил)амино]-DL-фенилаланин-нетропсин), или бис-нетропсин 1 (Pt-bis-NT), или 15-Лиз-бис-нетропсин (15Lys-bis-NT).

2. Средство, обладающее противогерпесвирусной активностью, представляющее собой сарколизин-нетропсин (4-[N,N-бис(2-хлорэтил)амино]-DL-фенилаланин-нетропсин).