ШТАММ MYCOBACTERIUM SPECIES ЦКМ В 65-Б, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПРЕСНОЙ И МОРСКОЙ ВОДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/14 C02F3/34 C12N1/14 C12R1/32 

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, пригодного для очистки пресной и морской воды от загрязнений нефтью в течение 7-14 суток в широком диапазоне температур (10-26^oC).

Известен штамм Pseudomonas putida 36 (1), обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов.

Однако недостатком данного штамма является неспособность расти и утилизировать нефть при низких температурах. Штамм Ps. putida 36 не пригоден к очистке загрязненной нефтью морской воды.

Известен штамм Mycobacterium flavescens (2), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-28^oC).

Недостатком данного штамма является неспособность к очистке от нефтезагрязнений морской воды.

Известен консорциум микроорганизмов под названием Devouroil (3), позволяющий очищать от нефтезагрязнений воду с высоким % солености (до 10%). Консорциум эффективно работает при температуре 28^oC.

Недостаток известного консорциума заключается в отсутствии способности к очистке нефтезагрязнений при низких температурах.

Задача изобретения - получение штамма бактерий, осуществляющих очистку морской и пресной воды от нефтезагрязнений в широком диапазоне температур (10-30^oC) в относительно короткие сроки.

Предлагаемый штамм Mycobacterium sp. выделен из пробы морской воды Белого моря (акватория Архангельского грузового порта). Штамм депонирован центральной коллекцией микроорганизмов Госконцерна "Биопрепарат", коллекционный номер ЦКМ В 65-Б.

В опытах на белых мышах штамм не вирулентен и нетоксичен.

Полученный штамм развивается из посевного материала на минеральной среде, используя в качестве источника углерода углеводороды нефти и нефтепродуктов, и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками.

Морфологические признаки.

В мазке видны грамположительные неподвижные, полиморфные: прямые и изогнутые палочки с размерами 5,0 - 6,0 х 0,6 - 0,8 мкм. При старении культура окрашивается грамвариабельно. На мясо-пептонном агаре через сутки появляются мелкие круглые с ровным краем колонии цвета топленого молока. Колонии непрозрачные, блестящие, маслянистые, легко снимаются с агара. На 3-4 сутки наряду с гладкими появляются шероховатые (3-4%) колонии. В мясо-пептонном бульоне культура дает равномерное помутнение и осадок на дне.

Физиологические и биохимические признаки.

Mycobacterium sp. ЦКМ В 65-Б является факультативным аэробом в широком диапазоне температур 4 - 37^oC. Из углеводов сбраживает глюкозу, сахарозу, маннозу, арабинозу, сорбит, дульцит, ксилозу, галактозу, маннит. Крахмал не гидролизует. Протеолитической активностью не обладает. Штамм каталазоположителен, оксидазоотрицателен; обладает уреазной активностью, нитраты не восстанавливает, фенилаланин и не дезаминирует. В дополнительных факторах роста не нуждается.

Культура хранится в лиофилизированном виде в ампулах при 4^oC. Жизнеспособность штамма можно поддерживать регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8Е с нефтью, а также на полноценной среде.

Способность предлагаемого штамма к биодеструкции нефти изучали применительно к морской и пресной воде, о чем свидетельствуют следующие примеры.

Пример 1. Утилизация нефтепродуктов в пресной воде.

Штамм Mycobacterium sp. ЦКМ В 65-Б выращивают в 250 мл колбах, содержащих 50 мл стерильной среды. Среду готовят на пресной воде, содержащей 0,75 г/л двузамещенного фосфата аммония. Стерильные нефтепродукты вносят по весу с точностью до 0,05 мг. Концентрация субстрата составляет 0,5% и 1%. Среды инфицируют двухсуточной агаровой культурой из расчета 10⁷ кл/мл. Колбы экспонируют в стационарных условиях при 26 и 10^oC в течение 14 суток, а также на качалке (150 об/мин) при 26^oC в течение 7 суток. В качестве контроля используют неинфицированные колбы со средой и нефтепродуктами. По истечении срока инкубации долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефтепродуктов хлороформом. Данные опытов представлены в табл. 1.

Утилизация нефти при исходном уровне загрязнения 0,5% в стационарных условиях при 26^oC составляет 48%. Снижение температуры до 10^oC приводит к снижению уровня очистки до 39%. Аэрация на качалке при 26^oC повышает скорость утилизации, через 7 суток (против 14 суток в стационарных условиях) очистка достигает 48%.

Утилизация диз. топлива в пресной воде при исходном уровне загрязнения 1% в стационарных условиях в течение 14 суток при 26^oC составляет 62%, при 10^oC 32%. Дополнительная аэрация на качалке при 26^oC повышает скорость утилизации диз. топлива, через 7 суток уровень очистки достигает 67%.

Пример 2. Утилизация нефтепродуктов в морской воде.

Штамм Mycobacterium sp. выращивают в 250 мл колбах, содержащих 50 мл стерильной среды. Среду готовят на морской воде (3,5% морской соли), содержащей 0,75 г/л двузамещенного фосфата аммония. Стерильные нефтепродукты вносят по весу с точностью до 0,05 мг. Концентрация субстрата составляет 0,5% нефти и 10% диз. топлива. Среды инфицируют двухсуточной агаровой культурой из расчета 10⁷ кл/мл. Колбы экспонируют в стационарных условиях при 26^oC и 10^oC в течение 14 суток, а также на качалке (150 об/мин) при 26^oC в течение 7 суток. В качестве контроля используют неинфицированные колбы со средой и нефтепродуктами. По истечении срока инкубации долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефтепродуктов хлороформом. Данные опыта представлены в табл. 2.

Утилизация нефти в морской воде при исходном уровне загрязнения 0,5% в стационарных условиях в течение 14 дней при 26^oC составляет 44.6% и практически не снижается при понижении температуры до 10^oC (42.6%). Дополнительная аэрация на качалке при 26^oC приводит к ускорению утилизации и повышению уровня очистки, через 7 суток (против 14 суток в стационарных условиях) очистка достигает 56%.

Утилизация диз. топлива в морской воде при исходном уровне загрязнения 1% в стационарных условиях в течение 14 суток при 26^oC составляет 45,6%, при 10^oC - 47,1%. Дополнительная аэрация на качалке при 26^oC повышает скорость утилизации диз. топлива: по истечении 7 суток уровень очистки достигает 82%.

Пример 3. Утилизация нефти в морской воде с различным содержанием морской соли.

Штамм Mycobacterium sp. выращивают в 250 мл колбах, содержащих 50 мл стерильной среды. Содержание морской соли в среде варьирует от 0 до 7,5%. В качестве дополнительной минеральной основы вносят двузамещенный фосфат аммония из расчета 0,75 г/л. Концентрация нефти составляет 0,5%. Среды инфицируют двухсуточной агаровой культурой из расчета 10⁷ кл/мл. Колбы экспонируют в стационарных условиях в течение 14 суток при 26^oC. В качестве контроля используют неинфицированные колбы со средой и нефтью. По истечении срока инкубации долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефти хлороформом. Данные опыта представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, штамм осуществляет утилизацию нефти даже при высоком уровне солености (7,5%) воды. Максимальный уровень биоочистки (56%) достигается при концентрации морской соли 3,5%.

Таким образом, предлагаемый штамм Mycobacterium sp. ЦКМ В 65-Б демонстрирует способность к биоочистке (50-82%) морской и пресной воды от нефтезагрязнений в широком диапазоне температур (10-26^oC) в относительно короткие сроки.

Предлагаемый штамм выгодно отличается от прототипа тем, что сохраняет способность к биодеградации нефти в соленой воде при понижении температуры с 26 до 10^oC. Кроме того, Mycobacterium sp. ЦКМ В 65-Б по сравнению с прототипом прекрасно развивается и утилизирует нефтепродукты в пресной воде в диапазоне температур 10-26^oC.

Вышеприведенные данные позволяют рекомендовать штамм Mycobacterium sp. ЦКМ В 65-Б для очистки пресной и морской воды от нефтезагрязнений.

Источники информации
1. Авт. св. СССР N 1076446, кл. С 12 N 15/00, 1984, Бюл. N 8.

2. Патент RU N 2053296, кл. С 12 N 1/20, 1996, Бюл. N 3.

3. Патент RU N 2023686, кл. С 02 F 3/34, 1994, Бюл. N 22.

Изобретение относится к области микробиологии. Предлагается новый штамм Mycobacterium species (депонирован в центральной коллекции микроорганизмов Госконцерна "Биопрепарат", коллекционный ЦКМ В 65-Б), выделенный из пробы морской воды Белого моря. Штамм пригоден для очистки пресной и морской воды (до 7,5% солености) от загрязнений нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне температур (10-26^oС). Технический результат изобретения - расширение области применения и эффективности очистки от нефтезагрязнений. 3 табл.

Штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б депонирован в центральной коллекции микроорганизмов Госконцерна "Биопрепарат", используемый для очистки пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур.