СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ - ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА Varicella-Zoster Herpes ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК C07H21/04 C12N15/38 C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано для диагностических целей выявления вируса Varicella-Zoster (VZV), относящегося к сем. Herpesviridaea, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению инфекции, вызываемых этим вирусом и называемых ветрянкой (характерной для детского возраста или опоясывающий лишай, как правило, встречающийся у взрослых людей).

Экспресс-диагностика инфекций, вызываемых этим вирусом, имеет важное значение в клинической практике, в особенности, у людей с ослабленным иммунитетом и когда требуется быстрый метод для подтверждения диагноза. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет непосредственно с высокой степенью чувствительности и достаточно быстро определить наличие вирусной ДНК в образце, позволяя решать задачи диагностики инфекционных заболеваний более эффективно. В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. ПЦР является прямым методом выявления вируса и имеет высокую степень чувствительности.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР, зависит определение строгой видоспецифичности; с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов.

Известны синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса Varicella-Zoster Herpes человека (патент США №6849407, МПК С12Q 1/68, опубл. 01.02.2005; Заявка США №2002182634, МПК G01N 33/53, опубл. 05.12.2002; Заявка США №2004259078, МПК С12Q 1/68, опубл. 23.12.2004; Заявка США №2007207453, МПК С12Q 1/70, опубл. 06.09.2007).

Однако во всех приведенных ссылках используют уникальные области генов: UL28 и UL29. В предлагаемой заявке на изобретение используют другой район: ген UL36, кодирующий тимидинкиназу, для которого было найдено в мировых базах данных максимальное количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов и клинических изолятов. Анализ максимального количества последовательностей позволяет надеяться, что выявленная нуклеотидная изменчивость этого гена близка к реальной ситуации изменчивости этого вируса. А, следовательно, выбранные праймеры будут выявлять максимальное количество изолятов VZV. Кроме того, фермент VZV-тимидинкиназа является одним из основных компонентов для реализации жизненной программы этого вируса и поэтому его последовательность является крайне консервативной.

Известны также синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК Herpes Simplex Virus.

Однако высокая степень специфичности ПЦР была достигнута за счет применения внутренних праймеров, т.н. «nested» ПЦР (P.Cassinotti et al., - Suitability and Clinical Application of a Multiplex Nested PCR Assey for the Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections. - J. Med. Virology, 50:75-81 (1996).

В качестве ближайшего аналога (прототипа) был взят аналогичный способ специфического определения ВПГ-1, ВПГ-2 и VZV, предусматривающий амплификацию ДНК в жидкой смеси, содержащей ДНК-полимеразу, водную жидкую пробу и комбинацию праймеров, соответствующих району генов UL15 генома ВПГ и UL42 генома VZV (J.M.Baron, A.Rubben, E-Ingrid Grussendorf-Conen. Evaluation of a new general primer pair for rapid detection and differentiation of HSV-1, HSV-2, VZV by Polimerase Chain Reaction. - J. of Medical Virology, 49, 279-282 (1996).

Однако выбранные праймеры не давали перекрестных реакций в ПЦР, если в качестве матрицы дополнительно использовали ДНК родственного генома, т.е. при определении ВПГ-1 вносили еще ДНК ВПГ-2, либо генетическую вариабельность амплифицированных нуклеотидных последовательностей из клинических образцов анализировали рестрикционным анализом.

Таким образом, общими недостатками известных аналогов и прототипа является дороговизна и недоступность предлагаемых различными зарубежными фирмами праймеров, а также трудоемкость проведения процедуры двухступенчатого анализа клинических образцов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является выявление ДНК VZV с высокой степенью специфичности в клинических образцах посредством таких олигонуклеотидов-праймеров, которые позволяют определять ДНК, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР.

Технический результат достигается подбором синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса Varicella-Zoster Herpes человека и имеющих следующий нуклеотидный состав:

P1: 5' GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'

Р2: 3' GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'

Подбор уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена UL-36 генома VZV, кодирующего тимидинкиназу, для которого было найдено наибольшее количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов и клинических изолятов. С этой целью были проанализированы области последовательностей генома VZV из имеющихся банков данных на предмет выявления консервативных районов ДНК, не имеющих гомологии у других герпесвирусов с тем, чтобы исключить возможность перекрестного реагирования близких видов и типов. Для выявления гомологии ДНК VZV были проанализированы консервативные участки генов, кодирующих основные белки-VZV, и из большого массива базы данных был выбран участок гена UL-36 (по наибольшему числу сопоставимых гомологии) и к нему подобраны праймеры следующего состава:

P1: 5' GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'

Р2: 3' GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'

специфичные к консервативному участку вариабельной части данного гена, кодирующего фермент тимидинкиназу. Компьютерный анализ вирусных пептидных последовательностей проводился с помощью программы SALIX, а с помощью компьютерной программы «OLIGO» были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции с данными праймерами.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе марки Термоцик МС 16, производитель «ДНК-технология», г.Москва.

ПЦР-продукт был подвергнут электрофорезу в агарозном геле, и о положительной реакции судили по полосе амплификата, соответствующей размеру 394 пар нуклеотидных оснований.

Перечень графических материалов:

- фиг.1 - нуклеотидная последовательность гена UL-36, амплифицируемая патентуемыми олигонуклеотидами-праймерами.

- фиг.2 - электрофореграмма амплифицируемого фрагмента генома VZV.

Идентификация ДНК VZV показана на следующих примерах.

Пример 1. Амплификация участка ДНК гена UL-36, кодирующего фермент тимидинкиназу

Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит: 10 мМ Mg - буфер «Unipol», 10 мМ d NTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК - матрицы, 0,5 ед. ДНК-полимеразы Tag, оставшийся объем занимает вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла.

Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 94°С - 1 мин, отжиг - 58° - 1 мин, синтез - 72° - 1 мин, далее 30 циклов по схеме: денатурация при 94°С в течение 0,5 мин, отжиг при 58°С - 0,5 мин, синтез при 72°С - 0,5 мин. Синтез на конечной стадии, т.е. в последнем цикле, проводят при 72°С в течение 2,5 мин.

Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности генома VZV длиной 394 bp (фиг.1).

Пример 2. Определение ДНК VZV в клинических образцах

Для апробации полученных праймеров использовали образцы клинического материала от больных в ПЦР. Клинические образцы представляли собой либо кровь (цельную или сыворотку), но чаще всего содержимое пузырьков на кожных покровах больного. Материал образцов ставили на переваривание с использованием протеиназы "К" (100 мкг\мл) в ТЕ-буфере с добавлением 1% лаурилсаркозила при 50°С в течение 1 ч. ДНК выделяли фенольной экстракцией. Протокол проведения ПЦР, идентичный приводимому в примере 1. На фиг.2 приведена электрофореграмма амплифицируемого фрагмента генома VZV. Дорожка 10 - ДНК, выделенного от больного в культуре клеток VZV; дорожки 1-9 - ДНК из клинических образцов.

Таким образом, заявленный технический результат получения высоко специфичных праймеров, позволяющих выявлять ДНК VZV для проведения ПЦР из различных клинических образцов, успешно достигается. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК VZV.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные консервативным участкам генов, кодирующих белки Varicella-Zoster (VZV), а именно участку гена UL-36. Изобретение позволяет посредством таких олигонуклеотидов-праймеров выявлять ДНК Varicella-Zoster с высокой степенью специфичности в клинических образцах и может быть использовано для решения научно-исследовательских задач по изучению инфекций, вызываемых этим вирусом. 2 ил.

Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса Varicella-Zoster Herpes человека и имеющие следующий нуклеотидный состав:
P1: 5' GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'
Р2: 3' GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'.