НАТРИЕВАЯ СОЛЬ [ПОЛИ-(2,5-ДИГИДРОКСИ-ФЕНИЛЕН)]-4-ТИОСУЛЬФОКИСЛОТЫ КАК РЕГУЛЯТОР МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТКИ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C07C381/02 C08G61/10 A61K31/05 

Изобретение относится к области биологии и медицины и касается препаратов, регулирующих метаболизм клетки.

Среди разрешенных к медицинскому применению препаратов имеется группа средств, оказывающих то или иное влияние на процесс метаболизма клетки и проявляющих многообразный физиологический эффект [1].

Например, цитохром C ускоряет ход окислительных процессов и применяется для улучшения тканевого дыхания.

Аденозинтрифосфат участвует во многих процессах обмена веществ и применяется для улучшения мозгового и коронарного кровообращения.

Ретаболил и другие анаболические стероиды оказывают положительное влияние на азотистый обмен, способствует фиксации кальция в костях.

Церебролизин, представляющий собой гидролизат мозгового вещества, применяют при нарушениях функций центральной нервной системы.

Более близким к предложенному способу можно признать убихинон, нормализующий состояние клетки в условиях гипоксии [2].

Наиболее близким структурным аналогом предложенного соединения является стэкинг-спирилизованный ортоолигомер, содержащий гексациклолинейные ядра, количество которых на виток спирали вторичной структуры названного олигомера равно от 2,6 до 3,0, при этом в спирали вторичной структуры олигомера содержится более 1, но менее 10 витков.

Примером такого стэкинг-спирилизованного олигомера может служить олиго-1,6-(2,5-диоксифенилен)тиосульфат натрия.

Известные соединения растворимы в воде, спирте, ацетоне, но не растворимы в диметиловом эфире.

Подобный олигомер обладает способностью оказывать регулирующее воздействие на функционирование биоэнергетических систем клеток эукариот и прокариот [3].

Способ получения упомянутого соединения заключается в том, что в водно-ацетоновой среде при температуре выше 37^oC подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия, отделяют осадок целевого продукта и удаляют из него примеси экстрагированием последних диметиловым эфиром.

Все перечисленные препараты имеют присущий каждому из них спектр свойств, определяющий характер их практического применения.

С этой точки зрения понятен интерес к веществам, влияющим на такие фундаментальные свойства клетки, как ее метаболизм.

Цель изобретения - расширить ассортимент средств, влияющих на метаболизм клетки.

В результате исследовательских усилий заявителем было установлено, что искомой активностью - способностью влиять на обмен веществ клетки - обладает натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты, представляющая собою циклолинейный полимер.

Предлагаемое полимерное соединение имеет следующую структурную формулу:
.

Молекулярная масса соединения может лежать в пределах от 352 до 784. Суммарная формула соединения NaS₂C_12+6nO_7+2nH_10+6n.

Оно представляет собой порошок черного цвета без запаха, обладающий солоноватым вкусом, содержит до 10% связанной воды.

Легко растворимо в воде, практически не растворимо в 95% этаноле, ацетоне, диэтиловом эфире.

Не имеет четкой температуры плавления.

Экстинция 0,003%-ного раствора в воде при длине волны 305 nm равняется 18,9 л/г•см.

УФ-спектр показывает ярко выраженный максимум при длине волны 305±1 nm (Фиг. 1).

Положение максимума не изменяется при изменении значений pH в диапазоне от 5,0 до 9,0, т.е. гипсо- и батохромные эффекты отсутствуют, что свидетельствует о том, что полимер не содержит спиральных структур.

Для ИК-спектра характерны полосы поглощения в области 610 - 630 см^-1, обусловленные валентными колебаниями группировок C-S и S-O; внеплоскостные деформационные колебания незамещенных атомов водорода в бензольном кольце в области 790 - 810 см^-1; деформационные колебания C-OH в ароматическом кольце в области 11195 - 1215 см^-1; валентные колебания группы C-S в области 1440 - 1460 см^-1 (фиг. 2). Остальные полосы поглощения, представленные на спектре, не являются характерными, перекрываются спектрами исходных продуктов, взятых в реакцию, и не идентифицировались.

Основное принципиальное отличие предложенного соединения от его ближайшего аналога состоит в том, что известное соединение имеет спиральную вторичную структуру, а предложенное соединение вторичной спиральной структурой не обладает, представляя собою циклолинейный полимер.

Кроме того, между известным и предложенным соединением существуют различия в растворимости: в отличие от известного соединения предложенное не растворимо в спиртах и в ацетоне.

В описании известного соединения его высокая биологическая активность связывалась именно с наличием вторичной спиральной структуры.

Однако, как было установлено заявителем, предложенное соединение хотя и не имеет вторичной спиральной структуры, сохраняет биологическую активность ранее известного соединения с вторичной спиральной структурой.

В данном случае факт сохранения биологической активности соединения с вторичной спиральной структурой у соединения, не имеющего вторичной спиральной структуры, не представляется очевидным и не вытекает из известного уровня знаний.

Биологическая активность предлагаемой натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты изучалась на клеточных культурах, микроорганизмах, животных, человеке и некоторые результаты приведены в табл. 1.

Исследования проводились классическим методом, многократно описанным в литературе (Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978 г.).

Из полученных результатов следует, что натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты стимулирует рост изолированных клеток ВНК-21, увеличивая накопление клеток приблизительно на 25%, при этом концентрация изучаемого вещества в 10 мг/мл не проявляла токсического действия. Этот показатель особенно важен, поскольку именно изолированные клетки животных являются наиболее чувствительными из всех "живых" тестов на токсичность.

Работы по активации препаратом производственного штамма Aspergillus niger проводились в производственных условиях получения лимонной кислоты. Препарат добавляли только в посевную питательную среду. В результате промышленного эксперимента в стандартных условиях было получено увеличение съема лимонной кислоты на 21%, экономия мелассы на 9%, сокращение времени производственного цикла на 10%.

Некоторые полученные результаты представлены в таблице 2.

Для оценки влияния исследуемого соединения на работоспособность использовали стандартную методику определения так называемой "продолжительности плавания", описанную, например, в Методических рекомендациях по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, одобренных Фармакологическим комитетом 11 апреля 1990 г. Протокол N 7.

Экспериментальным животным, в данном случае мышам, вводили предлагаемый препарат, помещали в сосуд с водой и оценивали их способность держаться на воде, выражающуюся в длительности свободного плавания. Контролем служили мыши, не получавшие препарат.

Некоторые полученные результаты содержатся в таблице 3.

Видно, что предлагаемое средство существенно повышает устойчивость мышей в экспериментальных условиях к физическим нагрузкам.

Аналогичные результаты были достигнуты при исследовании влияния натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты на выживаемость крыс в условиях экспериментальной гипоксии в условиях, описанных в упомянутых Методических рекомендациях (табл. 4).

Клинические исследования показали, что предложенный препарат нормализует иммунный статус пациентов при целом ряде патологий (табл.5).

Представленные результаты показывают, что предложенный препарат обладает способностью активизировать метаболизм клетки, повышает устойчивость животных к стрессовым нагрузкам, нормализует функционирование клеточных систем у человека.

Препарат не обладает концерогенностью и мутагенностью. Токсичность препарата низкая. Она составляет более 1500 мг/кг веса при внутривенном введении белым мышам при средней эффективной терапевтической ее дозировке на уровне 30 мг/кг веса.

Он может быть приготовлен в виде таких традиционных лекарственных форм, как раствор в ампулах, таблетки, мази, капсулы.

Способ получения натриевой соли [поли(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты заключается в том, что при температуре выше 60 градусов в водно-спиртовой среде подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия, отделяют осадок целевого продукта и очищают его путем экстракции примесей этиловым спиртом.

В оптимальном варианте осуществления предлагаемого способа раствор парабензохинона в органическом растворителе подвергают взаимодействию с водным раствором тиосульфата натрия, предпочтительно при температуре выше 60^oC, после чего отделяют образовавшийся осадок целевого продукта и очищают его экстракцией кипящим этиловым спиртом.

Способ получения заявляемого продукта отличается от способа получения наиболее близкого структурного аналога тем, что реакцию взаимодействия проводят в водно-спиртовой (а не в водно-ацетоновой) среде и при более высокой температуре (при температуре выше 60 градусов, в то время, как для получения известного соединения температура взаимодействия не должна превышать 37 градусов), а отделение примесей осуществляют экстракцией их спиртами, а не диметиловым эфиром.

Оптимальное молярное соотношение реагентов составляет от 1:2 до 1:10. Готовый продукт желательно промыть органическим растворителем, например спиртом, для удаления непрореагировавших веществ и примесей.

Концентрация исходного парабензохинона в органическом растворителе может составлять 5 - 16%. Концентрация тиосульфата в исходном водном растворе обычно составляет 20 - 30%.

Готовый продукт лучше промывать 2 - 3 раза 5 объемами растворителя. Препарат можно получить, исходя из гидрохинона, подвергая его окислению известным образом, а затем сочетая образовавшийся парабензохинон без промежуточного выделения с тиосульфатом натрия.

При взаимодействии парабензохинона и тиосульфата натрия образуется смесь продуктов, содержащих разное число циклолинейных структур в составе от 2 до 6 бензольных колец. Состав этой смеси может быть различным (Фиг. 3) и зависит от условий взаимодействия, что следует из данных табл. 6 - 8.

Следующие примеры более подробно иллюстрируют сущность предложения, не ограничивая его по существу.

Пример 1. В реакторе с мешалкой емкостью 50 л загружают 1 кг парабензохинона и заливают 19,6 л 96%-ного этилового спирта. Полученный 5% раствор перемешивают 10 - 15 минут, затем вливают 0,765 кг тиосульфата натрия, растворенного в 1,7 л дистиллированной воды. Соотношение тиосульфат : бензохинон составляет 1: 3. Смесь перемешивают в течение двух часов, поддерживая температуру в пределах 65 - 70 градусов. После завершения реакции смесь остужают, выпавший осадок отделяют, сушат, а затем экстрагируют кипящим этиловым спиртом в течение 24 часов. Полученный продукт сушат. Выход целевого продукта - 0,55 кг. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равняется 370. Содержание серы, определенное элементным анализом, составляет 19,2%.

Пример 2. В реактор с мешалкой емкостью 50 л загружают 1 кг парабензохинона и заливают 19,6 л 96%-ного этилового спирта. Полученный 5% раствор перемешивают 10 - 15 минут, затем вливают 0,38 кг тиосульфата натрия, растворенного в 0,9 л дистиллированной воды. Соотношение тиосульфат натрия : бензохинон составляет 1: 6. Смесь перемешивают в течение одного часа, поддерживая температуру в пределах 70^oC. После завершения реакции смесь остужают, выпавший осадок отделяют, сушат, затем экстрагируют кипящим этиловым спиртом в течение 24 часов. Полученный продукт сушат. Выход целевого продукта составляет 0,50 кг. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равняется 540. Содержание серы, определенное элементным анализом, составляет 14,5%.

Пример 3. В реактор с мешалкой емкостью 50 л загружают 1 кг парабензохинона и заливают 19,6 л 96%-ного этилового спирта. Полученный 5% раствор перемешивают 10 - 15 минут, затем вливают 0,26 кг тиосульфата натрия, растворенного в 0,6 л дистиллированной воды. Соотношение тиосульфат натрия : бензохинон составляет 1 : 9. Смесь перемешивают в течение трех часов, поддерживая температуру в пределах 80^oС. После завершения реакции смесь остужают, выпавший осадок отделяют, сушат, а затем экстрагируют кипящим этиловым спиртом в течение 24 часов. Полученный продукт сушат. Выход целевого продукта - 0,55 кг. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равняется 740. Содержание серы, определенное элементным аналогом, составляет 11,3%.

Таким образом, отличия предложенного способа от известного способа обеспечивают получение продукта, отличающегося от известного продукта.

Предложенный препарат, по сведениям заявителя, ранее не был описан, сведения о его влиянии на метаболизм клетки отсутствуют, способ его получения ранее не был известен.

В этой связи заявитель полагает, что его предложение соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению.

Изобретение относится к области биологии и медицины и касается веществ, регулирующих метаболизм клетки. Сущность изобретения: натриевая соль поли-(2,5-дигидроксифенилен)] -4-тиосульфкислоты формулы, мол. м. от 352 до 784. Его получают взаимодействием парабензохинона и тиосульфата натрия при молярном соотношении от 10:1 до 2:1 в водно-спиртовой среде при температуре выше 65^oC. Целевой продукт выделяют экстракцией спиртами и промывкой растворителем, например спиртом. 2 с.п. ф-лы, 8 табл., 3 ил.

1. Натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты общей формулы

где n 0 4,
как регулятор метаболизма клетки. 2. Способ получения натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты, отличающийся тем, что в водно-спиртовой среде подвергают взаимодействию парабензохинон и тиосульфат натрия при молярном соотношении от 10 1 до 2 1 и при температуре выше 65^oС выделяют целевой продукт из реакционной смеси и отделяют примеси.