АМИНОКИСЛОТНЫЙ ПРЕПАРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/195 A61K41/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к созданию противоопухолевого препарата на основе природных веществ.

В настоящее время поиск противоопухолевых химиотерапевтических средств направлен в сторону не только новых синтетических веществ, но в большой степени природных, более физиологичных и экологичных агентов. В частности, исследователи чаще обращаются к метаболитам растительных и животных клеток и тканей, продуктам жизнедеятельности микроорганизмов, витаминам, аминокислотам и их производным.

Известно противоопухолевое средство, представляющее собой п-ди-(2-хлорэтил)-D,L-фенилаланина гидрохлорид и вспомогательные фармацевтически приемлемые вещества (см. пат РФ №2144821, 2000 г.). Испытания проведены на лабораторных животных при экспериментальной лимфосаркоме, костной ретикулосаркоме, раке яичек и яичников. Цель изобретения - увеличение продолжительности жизни животных, повышение биодоступности препарата. Однако представленый препарат, содержащий ионы хлора, является достаточно токсичным для здоровых тканей млекопитающего.

В качестве еще одного аналога нашей разработки можно привести композицию для профилактики онкологических заболеваний при СПИДе. Композиция включает в основном три компонента: по меньшей мере одну аминокислоту, по меньшей мере один витамин и одно вещество, выбранное из группы: аденин, производное моносахарида, яблочная кислота (пат. РФ №2138257, 1999 г.). Роль аминокислот в такой композиции недостаточно ясна, и препарат скорее пригоден для поддержания жизнедеятельности ослабленного организма, например, при СПИДе.

Наиболее близким к заявляемому изобретению представляется композиция, состоящая из десяти природных аминокислот: валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, гистидин, серин, глутамат натрия, и трех микроэлементов: ионов марганца, кобальта, меди (пат. РФ №2125874, 1999). Композиция обладает противоопухолевым и антигипоксическим действием. Исследование проведено на лабораторных животных, при этом композиция из аминокислот и микроэлементов сравнивается по своему действию с классическими противоопухолевыми препаратами, например циклофосфаном, а также глицинато-серинатом меди.

Роль аминокислот как противоопухолевых агентов в данном препарате, по нашему мнению, не ясна, скорее всего цитотоксический эффект обеспечивается за счет действия ионов двухвалентной меди, которые, как следует из некоторых сообщений, обладают цитотоксическим эффектом в отношении опухолевых клеток (см. напр., Трещалина Е.М. и др. Вестник АМН СССР, 1986, №5, стр.51-56), а аминокислоты лишь обеспечивают проникновение токсических для опухоли ионов металлов в клетку.

Нами создан принципиально новый противоопухолевый препарат на основе незаменимых аминокислот, не имеющих по существу дополнительных химических агентов в своем составе.

По нашему мнению, помимо обычной классификации аминокислот для незаменимых аминосоединений следует ввести разграничение последних на способных к участию в анаболических (пластических) процессах в клетке и не способных к такому участию, как бы “апластических”. В процессе метаболического круговорота азота в биологической ткани, по нашему мнению, аминокислоты “изнашиваются” по мере их повторного использования в процессах анаболизма, их тонкая электронная структура изменяется, что улавливают чувствительные энзимы, участвующие в синтезе белка. В нормальной ткани такие аминокислоты катаболизируются до аммиака и углекислого газа, последние в дальнейшем попадают в почву, а с помощью работы азотфиксирующих микроорганизмов и некоторых других процессов продолжают круговорот азота с образованием в том числе новых “пластических” нативных аминокислот, в том числе незаменимых, попадающих в организм с пищей. Опухолевые клетки, как мы считаем, не “распознают” “апластические” аминокислоты и продолжают включать их в свой метаболический цикл.

Сведения о нарушении метаболизма азота в организме при прогрессирующих опухолях косвенно служат подтверждением нашей гипотезы. Азотистый баланс, как известно, означает разность между общим количеством азота, поступившим в организм человека, и общим количеством экскретируемого азота. Если азота поступает больше, чем экскретируется, говорят, что данный индивидуум имеет положительный азотистый баланс: последний положителен как у здорового растущего ребенка, так и у здоровой беременной женщины. Взрослый человек в норме находится в состоянии азотистого равновесия: потребление азота уравновешивается его выделением в составе фекалий и мочи. В состоянии отрицательного азотистого баланса количество выделяемого азота превышает количество азота, потребляемого организмом. Такое состояние наблюдается, например, при прогрессирующих формах рака (см. напр., А.Уайт и др. Основы биохимии, т.2. М.: Мир, 1981, с.902-904).

По нашим данным в крови здорового человека содержится менее 1% “апластичного” фенилаланина (АПФ) в сравнении с “пластичным”, тогда как в моче цифры АПФ увеличиваются в 3-5 раз, т.е. в нормальном организме АПФ в значительной степени выводится из организма.

Технической задачей настоящего изобретения является создание препарата на основе искусственно созданных “апластичных”, т.е. “модифицированных” с помощью нашей разработки, аминокислот и способа получения такого препарата.

Поставленная задача решается тем, что разработан аминокислотный препарат, обладающий противоопухолевым действием, при этом он содержит, по крайней мере, одну модифицированную незаменимую аминокислоту, полученную обработкой ультрафиолетовым излучением (УФ) при длине волны 250-350 нм и/или озоном, при этом модифицированная аминокислота нетоксична для здоровых клеток.

В частности, аминокислотный препарат содержит УФ-облученный фенилаланин с полосой испускания в области 410 нм.

Аминокислотный препарат, обработанный, как описано выше, может содержать одну или несколько по отдельности модифицированных аминокислот, выбранных из группы: фенилаланин, триптофан, лизин, лейцин.

Аминокислотный препарат, обработанный, как описано выше, может содержать смесь из четырех модифицированных аминокислот: фенилаланин, триптофан, лизин, лейцин.

Аминокислотный препарат, модифицированный, как описано выше, характеризуется тем, что каждую аминокислоту обрабатывают УФ в течение 12-80 часов при температуре 15-30°С.

Аминокислотный препарат характеризуется тем, что дополнительно может содержать одну или несколько фармацевтически приемлемых добавок: микроэлементы, и/или витамины группы В, и/или витамин С, и/или заменимые и/или незаменимые нативные аминокислоты.

Для препарата могут быть использованы различные вышеописанным образом по отдельности обработанные незаменимые аминокислоты в любом численном и/или качественном сочетании.

В качестве фармацевтических добавок могут быть использованы следующие вещества: микроэлементы, такие как Fe, Сu, Mg, Mn, Se, Те, Ti, Со, Мо и др., витамины группы В, такие как тиамин, рибофлавин, пиридоксин и др., витамин С. Кроме того, может содержать нативные аминокислоты, такие как аспарагин, глутамин, глицин, валин и др.

Другой задачей изобретения является способ получения препарата.

Способ заключается в следующем.

По крайней мере, одну незаменимую аминокислоту (в сухом виде) обрабатывают УФ-излучением при длине волны 250-350 нм и при температуре 15-30°С в течение 12-80 часов, или озоном при температуре 15-25°С с получением модифицированной аминокислоты.

Модифицированные аминокислоты смешивают в различных сочетаниях, при этом аминокислоты берут в равных соотношениях.

Исследование модифицированного препарата проведено методом флуоресцентного анализа облученного фенилаланина (см. фиг.1). Спектр был снят в течение 72 часов на 11 образцах, взятых через следующие промежутки времени (Т) облучения:

№ образца1234567891011Т, час024824283248525672

Приведенные спектры для каждого времени экспозиции - результат усреднения по 10 измерениям (из каждой пробирки бралось по 5 проб, измерения повторялись по 2 раза).

Необходимо обратить внимание, что появляются не одна полоса флуоресценции, а две.

На спектрах №2 и №3 (фиг.1)хорошо видна полоса испускания в области 392 нм (25500 см^-1). Эту же (чрезвычайно слабую) полосу можно увидеть и в спектре исходной аминокислоты до экспозиции. (Незначительное количество флуоресцирующего вещества образуется и при естественном облучении пробы до флуоресцентного анализа).

При увеличении времени экспозиции в спектрах быстро увеличивается интенсивность некоего “основного” компонента, образующегося под действием УФ-облучения с полосой испускания в области 410 нм (24380 см^-1). Появление этого “основного” компонента и придает исследуемой аминокислоте “модифицированность”. Однако первая полоса также присутствует в спектрах в виде небольшого “плеча” слева от максимума испускания основной полосы (третью полосу в районе 330 нм можно не принимать во внимание - это пик комбинационного рассеяния ОН-группы воды).

Максимальная интенсивность спектра наблюдали через 72 часа, после начала УФ-облучения (длина волны 250-350 нм). Дальнейшее УФ-облучение (105, 120 часов) не увеличивало образование “основного компонента” и не усиливало цитотоксический эффект на опухолевые клетки.

Время экспозиции для других аминокислот было выявлено следующее.

Триптофан 12-18 ч.

Лизин 60-72 ч.

Лейцин 46-56 ч.

При увеличении времени УФ-облучения фиксировали разрушение исследуемой аминокислоты (видимо, вследствие окисления аминогруппы), что можно определить по уменьшению реакции с нингидрином.

На фиг.2 представлены образцы трехмерных спектров флуоресценции облученного фенилаланина. Исходный образец (проба 1), облученный в течение 36 часов (проба 2) и облученный в течение 72 часов (проба 3). Из представленной фигуры видно нарастание пика “основного компонента” в области 410 нм.

Биологическая активность препарата была испытана на следующих аминокислотах: фенилаланин, триптофан, лейцин, лизин. Фенилаланин подвергали воздействию УФ в течение 72 часов при температуре 18°С с получением “модифицированного” фенилаланина (МФ), после чего добавляли воду для инъекций.

Изобретение подтверждается следующими примерами:

ПРИМЕР 1. Испытания проводили на культуре клеток Н-9 (пассируемые клетки лимфолейкоза человека). В качестве контроля использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров. Эксперимент проводили по следующей схеме:

- Клетки Н-9 сажали в 24-луночный планшет для культивирования в концентрации 250×10³/мл по 1,0 мл на 1 лунку. Каждый вариант опыта ставился на 5 повторах.

- Препарат МФ разводили в воде для инъекций и добавляли в опытные лунки в количестве 500, 250 и 100 мкг/мл.

- В контрольные лунки добавляли соответствующее количество среды для культивирования.

- Состав среды для культивирования: RPMI-1640 с 10% ЭТС + глютамин 146 мг на 500 мл + гентамицин 20 мг на 500 мл.

- Клетки инкубировали 24 и 48 часов в СО₂ инкубаторе при 37°С.

- После инкубации считали количество и % мертвых клеток с добавлением трепанового синего.

Результат исследования приведен в таблице 1. Из представленных данных в таблице видно, что МФ оказывает цитотоксический эффект на жизнеспособность опухолевых клеток Н-9 в дозах 100, 250 и 500 мкг/мл, из таблицы также видно, что увеличение дозы препарата не приводит к усилению цитотоксического эффекта.

Таблица 1Концентрация препарата МФ, кол-во опытовПосле 24 ч инкубацииПосле 48 ч инкубации Кол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроляКол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроля1. Контроль, n=50,22±0,128,3±2,4-0,25±0,118,1±2,3-2. 100 мкг/мл, n=100,19±0,1133,3±4,2301±27,50,19±0,1035,5±4,3338±18,73. 250 мкг/мл, n=100,17±0,1152,5±7,3532±38,60,16±0,0952,7±8,3550±45,74. 300 мкг/мл, n=100,18±0,1058,3±7,4557±20,10,18±0,1152,5±7,8536±29,4

Препарат МФ в исследованных концентрациях оказывает цитотоксический эффект на жизнеспособность клеток лейкоза Н-9. Большая выраженность эффекта наблюдается в дозах 250 и 500 мкг/мл.

ПРИМЕР 2. В контрольной серии опытов использовали мононуклеары (лимфоциты) периферической крови здорового человека, которые помещали в 24-луночный планшет для культивирования и проводили опыт, как описано в примере 1 с участием МФ (см.таблицу 2).

Таблица 2Концентрация препарата МФ, кол-во опытовПосле 24 ч инкубацииПосле 48 ч инкубации Кол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроляКол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроля1. Контроль, n=100,24±0,16,0±1,4-0,25±0,126,1±1,3-2. 100 мкг/мл, n=100,24±0,104,9±1,218,3±5,30,24±0,115,5±1,39,8±2,63. 250 мкг/мл, n=100,23±0,124,7±1,421,7±5,60,24±0,105,7±1,36,6±1,74. 500 мкг/мл, n=100,24±0,114,7±1,621,7±4,20,23±0,116,2±1,91,6±0,3

Препарат МФ в дозах 100-500 мкг/мл не оказывал цитотоксического эффекта на лимфоциты здорового донора.

ПРИМЕР 3. В экспериментах была проведена оценка цитотоксического эффекта “модифицированного” триптофана (МТ) в суспензионной культуре клеток лейкоза человека Н-9. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3Концентрация препарата МТ, кол-во опытовПосле 24 ч инкубацииПосле 48 ч инкубации Кол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроляКол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроля1. Контроль, n=100,23±0,087,5±0,6-0,24±0,089,3±0,7-2. 10 мкг/мл, n=100,21±0,0916,2±0,9116±10,80,23±0,0827,3±2,8193±18,93. 50 мкг/мл, n=100,21±0,0818,4±1,3145±11,90,22±0,0725,2±2,6171±17,14. 100 мкг/мл, n=100,19±0,0620,1±1,4168±12,30,20±0,0531,3±3,6236±21,55. 250 мкг/мл, n=100,18±0,0731,б±2,1321±23,50,19±0,0643,3±4,3366±33,76. 500 мкг/мл, n=100,17±0,0833,7±3,1349±31,20,19±0,0749,0±4,9427±39,3

Препарат МТ в исследованных концентрациях оказывает цитотоксический эффект на жизнеспособность клеток Н-9. Наблюдается линейный рост цитотоксичности в зависимости от концентрации.

ПРИМЕР 4. Проведены исследования на смеси “модифицированных” аминокислот (МСА): фенилаланина, лейцина и лизина. Условия экперимента аналогичны вышеописанным, относящимся к клеткам лейкоза человека Н-9.

Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4Концентрация МСА, кол-во опытовПосле 24 ч инкубацииПосле 48 ч инкубации Кол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроляКол-во клеток в лунке в млн/мл% мертвых клеток% отклонения от контроля1. Контроль, n=100,22±0,087,6±0,5-0,24±0,089,2±0,7-2. 400 мкг/мл, n=100,17±0,0858,5±5,1680±58,10,18±0,0667,5±6,1626±59,93.1000 мкг/мл, n=100,17±0,0782,3±6,3997±82,10,18±0,0795,5±8,1927±89,7

Смесь вышеуказанных “модифицированных” аминокислот в исследованных концентрациях оказывает сильный цитотоксический эффект на опухолевые клетки.

Предлагаемое изобретение открывает новые пути поиска противоопухолевых препаратов природного происхождения, физиологичных, не обладающих цитотоксичностью в отношении нормальных клеток, позволяющих бороться с такими тяжелыми заболеваниями, как раковые.

Изобретение относится к области медицины, в частности к созданию противоопухолевого препарата на основе природных веществ. Сущностью изобретения является аминокислотный препарат, содержащий, по крайней мере, одну модифицированную незаменимую аминокислоту, полученную обработкой ультрафиолетовым излучением (УФ) при длине волны 250-350 нм в течение 12-80 часов при температуре 15-30°С или озоном при температуре 15-25°С, при этом модифицированная аминокислота не токсична для здоровых клеток, а также способ получения такого препарата. Техническим результатом является создание противоопухолевого препарата на основе модифицированных аминокислот и расширение арсенала противоопухолевых препаратов, не цитотоксичных для нормальных клеток. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

1. Аминокислотный препарат, обладающий противоопухолевым действием, отличающийся тем, что он содержит, по крайней мере, одну модифицированную незаменимую аминокислоту, полученную обработкой ультрафиолетовым излучением (УФ) при длине волны 250-350 нм в течение 12-80 ч при температуре 15-30°С или озоном при температуре 15-25°С, при этом модифицированная аминокислота не токсична для здоровых клеток.2. Аминокислотный препарат по п.1, отличающийся тем, что содержит УФ-облученный в течение 12-18 ч фенилаланин с полосой испускания в области 410 нм.3. Аминокислотный препарат по п.1, отличающийся тем, что содержит одну или несколько модифицированных аминокислот, выбранных из группы фенилаланин, полученный при экспозиции в течение 36-72 ч, триптофан, полученный при экспозиции в течение 12-18 ч, лизин, полученный при экспозиции в течение 60-72 ч, лейцин, полученный при экспозиции в течение 46-56 ч.4. Аминокислотный препарат по п.1 и 3, отличающийся тем, что содержит смесь из четырех модифицированных аминокислот: фенилаланина, триптофана, лизина, лейцина.5. Аминокислотный препарат по п.1, отличающийся тем, что каждую аминокислоту обрабатывают УФ-излучением в течение 12-80 ч при температуре 15-30°С.6. Аминокислотный препарат по п.1, отличающийся тем, что дополнительно может содержать одну или несколько фармацевтически приемлемых добавок: микроэлементы, и/или витамины группы В, и/или витамин С, и/или заменимые и/или незаменимые нативные аминокислоты.7. Способ получения аминокислотного препарата с противоопухолевым действием, отличающийся тем, что, по крайней мере, одну незаменимую аминокислоту обрабатывают УФ-излучением при длине волны 250-350 нм в течение 12-80 ч и при температуре 15-30°С или озоном при температуре 15-25°С с получением модифицированных аминокислот, не токсичных в отношении здоровых клеток.8. Способ по п.6, отличающийся тем, что модифицированные аминокислоты смешивают в различных сочетаниях, при этом аминокислоты берут в равных соотношениях.